【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及高通量测序，具体来说，涉及可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、富集的方法。
技术介绍
1、线粒体是所有人体细胞中必不可少的细胞器，在真核细胞中参与细胞凋亡、稳态、衰老等多种生命活动，与多种疾病和炎症有关，线粒体与细胞核在胞内共存，是哺乳动物唯一的半自主细胞器。线粒体拥有一套独立的遗传物质，即线粒体基因组(mtdna)，是一个闭合的圆形双链分子，以多拷贝的形式存在于真核细胞中，mtdna长度约为16.6kb，包含37个基因，其中13个是编码氧化磷酸化复合物的核心结构成分。在胞内共存的过程中，会出现基因转移的现象，遗传物质可以从线粒体转移到细胞核并将其整合到细胞核基因组中，成为核线粒体dna(nuclear mitochondrial dna，numt)。
2、mtdna因其不同于核基因组的结构特征及d-环复制方式，导致存在突变率异常高的情况，其水平可能是核dna突变率的100-1000倍。目前，已有大量致病性mtdna变异被发现，涉及如糖尿病、阿尔兹海默病、帕金森、癌症等多种疾病，线粒体功能障碍可由mtdna耗竭，以及其中的点突变、缺失、重复等变异形式引起。因此，准确检测mtdna变异对线粒体疾病的确诊具有重要意义。
3、目前，已有多种方法可以用来对mtdna进行测序，包括通过氧化铯密度梯度离心法进行mtdna的富集、克隆后测序；以及应用长片段pcr、液/固相探针杂交捕获和多重pcr等方法。但现有的方法有其本身的局限性，如mtdna的物理富集方法费时费力，所需样本量大；长片段pcr法扩增片
4、针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
技术实现思路
1、针对相关技术中的问题，本专利技术提出可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、富集的方法，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题。
2、为此，本专利技术采用的具体技术方案如下：
3、可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、富集的方法，该可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、富集的方法包括以下步骤：
4、s1、采用核酸外切酶v对人全血dna样本中的核基因组dna进行酶切消化反应，生成分离后的mtdna；
5、s2、对mtdna进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，依据电泳条带的大小及有无判断人全血dna样本中的核基因组dna是否完全消化；
6、s3、对mtdna进行等温滚环扩增富集，生成等温滚环扩增产物；
7、s4、将等温滚环扩增产物作为底物进行dna测序文库构建，并利用dna测序文库对mtdna进行测序。
8、进一步的，酶消化反应的反应体系包括限制性内切酶缓冲液、三磷酸腺苷、核酸外切酶v及核基因组dna。
9、进一步的，对mtdna进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，依据电泳条带的大小及有无判断人全血dna样本中的核基因组dna是否完全消化包括以下步骤：
10、s21、将酶切消化反应中产生的酶切消化产物与未消化的人全血dna样本分别按照预设比例添加装载缓冲液；
11、s22、将两组样本分别与dna标记物上样于预先配置的琼脂糖凝胶中并在110v的电压下进行电泳；
12、s23、依据电泳条带的大小及有无判断人全血dna样本中的核基因组dna是否完全消化。
13、进一步的，对mtdna进行等温滚环扩增富集，生成等温滚环扩增产物包括以下步骤：
14、s31、采用随机引物对mtdna进行等温滚环扩增，并在冰上配置pcr扩增反应体系，pcr扩增反应体系包括第一组分及第二组分；
15、s32、将第一组分置于95℃水浴中变性，并在变性结束后将其置于冰上冷却；
16、s33、将第二组分加入至冷却完成后的第一组分中混匀离心后置于pcr仪上孵育，生成等温滚环扩增产物；
17、s34、分别利用dna清洁&浓缩-5试剂盒及双链dna荧光定量检测试剂盒对等温滚环扩增产物进行收集和定量处理。
18、进一步的，第一组分包括酶切消化产物、限制性内切酶缓冲液、二硫苏糖醇、随机引物及无核酸酶水；
19、第二组分包括脱氧核苷酸及phi29 dna聚合酶。
20、进一步的，将等温滚环扩增产物作为底物进行dna测序文库构建，并利用dna测序文库对mtdna进行测序包括以下步骤：
21、s41、利用超声打断仪对等温滚环扩增产物进行片段化处理，生成片段化产物；
22、s42、将片段化产物进行末端修复，并在末端修复完成后的片段化产物中添加单碱基a，生成修复产物；
23、s43、对修复产物进行接头连接反应，生成接头连接产物；
24、s44、对接头连接产物分别进行磁珠纯化和片段筛选；
25、s45、构建dna测序文库，并利用构建的dna测序文库进行上机测序。
26、进一步的，对接头连接产物分别进行磁珠纯化和片段筛选包括以下步骤：
27、s441、吸取预设质量的vahtsdna清洁磁珠加入至接头连接产物中进行初次纯化，生成初次纯化产物；
28、s442、在初次纯化产物中再次添加vahtsdna清洁磁珠进行二次纯化，生成二次纯化产物；
29、s443、在二次纯化产物中再次添加vahtsdna清洁磁珠进行最终纯化，生成最终纯化产物；
30、s444、利用双链dna荧光定量检测试剂盒及分析仪分别对最终纯化产物进行浓度测定和片段大小测定。
31、进一步的，吸取预设质量的vahtsdna清洁磁珠加入至接头连接产物中进行初次纯化，生成初次纯化产物包括以下步骤：
32、s4411、将预设质量的vahtsdna清洁磁珠和接头连接产物加入至pcr管中混合并置于室温孵育；
33、s4412、将pcr管离心置于磁力架中，并将pcr管内部的磁珠和第一混合溶液分离，在第一混合溶液澄清后移除上清；
34、s4413、利用预先配制的乙醇漂洗磁珠，将漂洗完成后的磁珠置于室温孵育后移除上清；
35、s4414、干燥磁珠至无乙醇残留后加入无核酸酶水，混合均匀后于室温放置；
36、s4415、将pcr管离心置于磁力架中静置，在pcr管内部的第二混合溶液澄清后吸取上清至新的ep管中，得到初次纯化产物。
37、进一步的，在初次纯化产物中再次添加vahtsdna清洁磁珠进行二次纯化本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、富集的方法，其特征在于，该可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、富集的方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、富集的方法，其特征在于，所述酶消化反应的反应体系包括限制性内切酶缓冲液、三磷酸腺苷、核酸外切酶V及核基因组DNA。
3.根据权利要求1所述的可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、富集的方法，其特征在于，所述对mtDNA进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，依据电泳条带的大小及有无判断人全血DNA样本中的核基因组DNA是否完全消化包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、富集的方法，其特征在于，所述对mtDNA进行等温滚环扩增富集，生成等温滚环扩增产物包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、富集的方法，其特征在于，所述第一组分包括酶切消化产物、限制性内切酶缓冲液、二硫苏糖醇、随机引物及无核酸酶水；
6.根据权利要求1所述的可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、
7.根据权利要求6所述的可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、富集的方法，其特征在于，所述对接头连接产物分别进行磁珠纯化和片段筛选包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、富集的方法，其特征在于，所述吸取预设质量的VAHTSDNA清洁磁珠加入至接头连接产物中进行初次纯化，生成初次纯化产物包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、富集的方法，其特征在于，所述在初次纯化产物中再次添加VAHTSDNA清洁磁珠进行二次纯化，生成二次纯化产物包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、富集的方法，其特征在于，所述在二次纯化产物中再次添加VAHTS DNA清洁磁珠进行最终纯化，生成最终纯化产物包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、富集的方法，其特征在于，该可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、富集的方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、富集的方法，其特征在于，所述酶消化反应的反应体系包括限制性内切酶缓冲液、三磷酸腺苷、核酸外切酶v及核基因组dna。
3.根据权利要求1所述的可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、富集的方法，其特征在于，所述对mtdna进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，依据电泳条带的大小及有无判断人全血dna样本中的核基因组dna是否完全消化包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、富集的方法，其特征在于，所述对mtdna进行等温滚环扩增富集，生成等温滚环扩增产物包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的可用于人全血样本中环状线粒体基因组分离、富集的方法，其特征在于，所述第一组分包括酶切消化产物、限制性内切酶缓冲液、二硫苏糖醇、随机引物及无核酸酶水；
6.根据权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：边佳昕，颜丙霄，范衡宇，肖锐，陆利，孙冬梅，陈博，
申请(专利权)人：浙江大学绍兴研究院，
类型：发明
国别省市：
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