【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，尤其涉及一种用于蛋白表达的真核mcv启动子及其应用。
技术介绍
1、真核启动子是一段dna序列，主要负责启动下游特定rna转录本的转录工作，如下游rna转录本编码蛋白的序列，真核启动子可以转录下游蛋白开放阅读框，将其转录为mrna，从而表达成蛋白质。
2、真核启动子是真核生物基因转录必须的关键元件，是影响基因转录效果的关键，在蛋白表达、基因治疗、基因工程载体疫苗、育种等领域广泛被应用。然而，目前最常用的启动子包括sv40、cmv、avian actin启动子等，可选择的种类较少，而且其中部分启动子如sv40的转录效率较低。随着生物技术的快速发展，对启动子的需要也在增加，特别是在同一动物或者载体中多次使用相同的启动子，会造成同源重组现象，导致蛋白表达、基因治疗、基因工程载体疫苗、育种等研究产品不稳定。目前急需不同种类的启动子可供选择与使用。
技术实现思路
1、本专利技术要解决现有启动子种类少的技术问题，提供一种用于蛋白表达的真核mcv启动子，增加了启动子的种类，且包含该启动子的载体pmcv可以在哺乳细胞中高效表达外源蛋白。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现:
3、在本专利技术的一个方面，提供了一种真核启动子，该真核启动子为鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus，mcv)的启动子，其核苷酸序列如seq id no.1所示，或是与seqid no.1所示核苷酸序列具有80％以上同源性的
4、所述启动子中含有关键元件tatataa。
5、在本专利技术的另一方面，还提供了一种包含上述真核启动子的载体。
6、优选的，所述载体为蛋白表达载体，是一种环状载体，命名为pmcv，包含原核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒，该外源基因表达盒自上游至下游依次由上述真核mcv启动子、连接片段和多聚腺苷酸加尾信号组成，所述连接片段含有afei识别序列。
7、更优选的，所述多聚腺苷酸加尾信号为牛生长激素基因多聚腺苷酸加尾序列(bghpolya)。
8、所述蛋白表达载体，还可利用pcr方法扩增获得pmcv线性载体。
9、在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述蛋白表达载体的构建方法，利用同源重组技术构建载体，包括以下步骤：
10、1)以鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus，mcv)的dna为模板，用如下引物进行pcr扩增，得到启动子片段a(seq id no.1)；
11、5'taaccgtattaccgccatgcatttggagccaagtacattg3'(seq id no.2)
12、和5'actagaaggcacagggtggcgctctgcgttctacggtgg'(seq id no.3)
13、2)以pcdna3.0质粒为模板，用如下引物进行pcr扩增，得到片段b；
14、5'gccaccctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgccc3'(seq id no.4)
15、和5'ttgactcaatgtacttggctccaaatgcatggcggtaatacggtta 3'(seq id no.5)
16、3)将片段a和片段b导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段a和片段b连接，获得蛋白表达载体，即重组pmcv载体。
17、在本专利技术的另一方面，还提供了一种表达外源基因的重组载体的构建方法，包括以下步骤：
18、将包含上述真核启动子的载体线性化；
19、把线性化载体和外源基因片段加入感受态细胞中混匀，置冰浴25～40分钟；
20、42℃水浴热激80～100秒，然后冰上放置2～5分钟，加入预热的lb培养基，置于37℃下，180～200rpm振摇80～100分钟；
21、收集菌体，用lb液体培养基重悬菌体，取重悬液涂布含有氨苄青霉素的lb板上，37℃培养12～16小时；
22、挑取单克隆提取质粒，该质粒即为表达外源基因的重组载体。
23、优选的，所述线性化是用pcr方法扩增线性化载体。
24、在本专利技术的另一方面，还提供了上述真核启动子在制备蛋白表达载体、基因工程疫苗、或基因治疗产品中的应用。
25、在本专利技术的另一方面，还提供了上述载体在制备穿梭载体、外源基因表达载体、基因工程疫苗、基因治疗产品、或育种产品中的应用。
26、本专利技术用于蛋白表达的真核mcv启动子，不仅增加了启动子的种类，而且包含该启动子的载体pmcv可以在哺乳细胞中高效表达外源蛋白，该pmcv载体还可利用同源重组构建表达外源基因的重组载体，避免了传统的酶切，连接等环节，整个构建过程中不使用任何内切酶与连接酶，比传统的连接过程省略了2-3个步骤，连接的效率也较理想。本专利技术的pmcv载体，构建表达外源基因的重组载体，过程简便、快速、经济、高效，可快速完成大量外源基因的表达载体的构建，具有很好的应用前景。
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1.一种真核启动子，其特征在于，所述启动子为真核MCV启动子，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示，或是与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有80％以上同源性的序列。
2.包含权利要求1所述真核启动子的载体。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体为蛋白表达载体。
4.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体包含原核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述外源基因表达盒包含权利要求1所述真核启动子、连接片段和多聚腺苷酸加尾信号。
6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于，所述多聚腺苷酸加尾信号为牛生长激素基因多聚腺苷酸加尾序列。
7.一种表达外源基因的重组载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述线性化是用PCR方法扩增线性化载体。
9.权利要求1所述真核启动子在制备蛋白表达载体、基因工程疫苗、或基因治疗产品中的应用。
10.权利要求2-6任一项所述载
...【技术特征摘要】
1.一种真核启动子，其特征在于，所述启动子为真核mcv启动子，其核苷酸序列如seqid no.1所示，或是与seq id no.1所示核苷酸序列具有80％以上同源性的序列。
2.包含权利要求1所述真核启动子的载体。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体为蛋白表达载体。
4.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体包含原核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述外源基因表达盒包含权利要求1所述真核启动子、连接片段和多聚腺苷...
【专利技术属性】
技术研发人员：李泽君，刘芹防，闫大为，滕巧泱，苑纯秀，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，
类型：发明
国别省市：
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