【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸检测，特别涉及一种级联放大crispr-dx检测体系。
技术介绍
1、核酸检测技术(crispr-based diagnostics，crispr-dx)是基于crispr-cas12和crispr-cas13家族的反式切割特性开发的检测技术。
2、长期以来，聚合酶链式反应(pcr)及其衍生技术如常规pcr、荧光定量pcr、数字微滴pcr等一直是核酸检测金标准。但pcr反应需要变性、退火、延伸三个步骤，对设备和操作人员要求较高、需要高温条件、容易出现非特异性扩增、反应时间较长(1～2小时)，使其应用局限于医疗检验机构。重组酶聚合酶等温扩增技术(rpa)检测反应较快(20分钟)，可以在常温下反应，但其特异性较差，易出现非特异性扩增，易受环境核酸污染的影响而出现假阳性结果。crispr-dx可以在室温条件下快速反应，且拥有良好的特异性，但单独使用时灵敏度不足，在核酸浓度较低时易出现漏诊。
3、由于crispr-dx的灵敏度仍有待优化，有研究团队将其与rpa相结合，达到了显著提高了灵敏度的目的。可惜的是rpa易出现非特异性扩增，导致结合后的检测技术精确性降低。
4、现有技术倾向于采用级联放大的方法，通过将与模板结构类似的脱氧核糖核酸(dna)底物加入反应体系，达到无需扩增而可以以极高的灵敏度和特异性极低浓度dna模板的效果，如：1、通过加入dna/rna底物达到级联放大效果，但检测限为pm级，灵敏度不足，且反应时间需要100分钟，需要cas12、cas13两种酶、dna/rna底物
技术实现思路
1、本专利技术目的在于公开了一种级联放大crispr-dx检测体系，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
2、为实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：
3、本专利技术第一方面在于提供一种级联放大crispr-dx检测体系。
4、本专利技术第一方面提供的检测体系包括底物片段、通用crrna和lbcas12a，所述底物片段的核苷酸序列如seq id no:1或seq id no:2所示，所述通用crrna的核苷酸序列如seqid no:3所示。所述底物片段依次包括第一互补区、环形区和第二互补区，所述第一互补区和所述第二互补区互补配对。所述lbcas12a与所述通用crrna结合后形成通用crrna-lbcas12a复合物。通用crrna-lbcas12a复合物对底物片段所述环形区的单链进行切割，使所述底物片段结构发生改变。结构改变后的底物可以作为模板被通用crrna识别，从而进一步激活更多通用crrna-lbcas12a复合物，实现级联放大反应。
5、所述底物片段的核苷酸序列为：
6、5’-gggggcaacggatatgactgggacaacttttttttttttttttatttcccagtcatatccg-3’(seq id no:1)或，
7、5’-gggggcaacggatattactgggacaacttttttttttttttttatttcccagtaatatccgttgccccc-3’(seq id no:2)。
8、所述通用crrna的核苷酸序列为：
9、5’-uaauuucuacuaaguguagauguugucccagucauauccguugctattatt-3’(seq id no:3)。
10、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述底物片段经退火处理后折叠形成具有茎状部分和环状部分的茎环结构，所述第一互补区和所述第二互补区互补配对形成双链的茎状部分，所述环形区的两端分别与所述第一互补区和所述第二互补区连接形成单链的环状部分。
11、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述退火处理的反应体系包括退火缓冲液、所述底物片段和无酶水。所述dna退火缓冲液可选择市售产品，例如碧云天的d0251。
12、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述退火处理的反应程序为：98℃，持续1分钟；以每分钟下降1℃的速率降至25℃；25℃保存。所述退火处理过程通过升温打开氢键，匀速降温使得所述第一互补区能够与所述第二互补区相互识别配对，从而形成所述茎环结构。
13、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述检测体系还包括缓冲液、氯化镁溶液、rna酶抑制剂、检测crrna和探针。所述crispr-dx检测体系具有多种拓展的可能性，可以根据不同的使用场景和使用需求包括但不限于制备为荧光检测试剂盒或胶体金试纸条等。荧光检测试剂盒通过含有待测样品的实验组与不添加待测样品的空白组进行对照实验，由荧光值比值进行判读，从而得出待测样品中是否含有模板片段。
14、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述探针的5’端连接有荧光基团、3’端连接有荧光猝灭基团。
15、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述探针的核苷酸序列为5’-ttattatt-3’。
16、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述检测crrna的核苷酸序列如seq idno:4所示。如seq id no:4所示的检测crrna用于检测erbb2基因。进一步可以根据其他基因的保守序列设计相应的检测crrna也能够利用本检测体系实现级联放大的检查反应。
17、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述缓冲液为10×holmes缓冲液。
18、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述检测体系的体积为20μl，包括10×holmes缓冲液2μl，浓度为25mm的氯化镁溶液1.5μl，40u/μl的rna酶抑制剂0.25μl，浓度为1μm的所述通用crrna 0.25μl，浓度为1μm的所述检测crrna0.25μl，浓度为10pmol/μl的lbcas12a 0.5μl，浓度为10mm的所述探针1μl，稀释200倍含有所述底物片段的底物溶液1μl，无酶水12.25μl，待测样品溶液1μl。
19、本专利技术的优点在于：
20、(1)通过在crispr-dx反应体系中加入所述底物片段和所述通用crrna，所述底物片段的环形区能产生空间位阻，使底物片段无法直接被被通用crrna-lbcas12a复合物识别。当靶gdna存在时通用crrna-lbcas12a复合物会顺式切割靶gdna，而后反式切割环形区的单链区，使底物片段发生变构，环形区变为线性。失去空间位阻的底物片段可以被通用crrna-lbcas12a复合物识别，从而激活更多cas蛋白，反式切割更多探针，产生更高荧光。
21、(2)灵敏度高则不需要使用rpa扩增，避免了rpa的非特异本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种级联放大CRISPR-Dx检测体系，其特征在于，包括底物片段、通用CrRNA和Lbcas12a，所述底物片段的核苷酸序列如SEQ ID No:1或SEQ ID No:2所示，所述通用CrRNA的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。
2.根据权利要求1所述检测体系，其特征在于，所述底物片段经退火处理后折叠形成具有茎状部分和环状部分的茎环结构，所述第一互补区和所述第二互补区互补配对形成双链的茎状部分，所述环形区的两端分别连接所述第一互补区和所述第二互补区连接形成单链的环状部分。
3.根据权利要求2所述检测体系，其特征在于，所述退火处理的反应体系包括退火缓冲液、所述底物片段和无酶水。
4.根据权利要求3所述检测体系，其特征在于，所述退火处理的反应程序为：98℃，持续1分钟；以每分钟下降1℃的速率降至25℃；25℃保存。
5.根据权利要求1所述检测体系，其特征在于，还包括缓冲液、氯化镁溶液、RNA酶抑制剂、检测CrRNA和探针。
6.根据权利要求5所述检测体系，其特征在于，所述探针的5’端连接有荧光基团、3’端连接有
7.根据权利要求6所述检测体系，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为5’-TTATTATT-3’。
8.根据权利要求5所述检测体系，其特征在于，所述检测CrRNA的核苷酸序列如SEQ IDNo:4所示。
9.根据权利要求5所述检测体系，其特征在于，所述缓冲液为10×HOLMES缓冲液。
10.根据权利要求9所述检测体系，其特征在于，所述检测体系的体积为20μL，包括10×HOLMES缓冲液2μL，浓度为25mM的氯化镁溶液1.5μL，40U/μL的RNA酶抑制剂0.25μL，浓度为1μM的所述通用CrRNA 0.25μL，浓度为1μM的所述检测CrRNA 0.25μL，浓度为10pmol/μL的Lbcas12a 0.5μL，浓度为10mM的所述探针1μL，稀释200倍含有所述底物片段的底物溶液1μL，无酶水12.25μL，待测样品溶液1μL。
...【技术特征摘要】
1.一种级联放大crispr-dx检测体系，其特征在于，包括底物片段、通用crrna和lbcas12a，所述底物片段的核苷酸序列如seq id no:1或seq id no:2所示，所述通用crrna的核苷酸序列如seq id no:3所示。
2.根据权利要求1所述检测体系，其特征在于，所述底物片段经退火处理后折叠形成具有茎状部分和环状部分的茎环结构，所述第一互补区和所述第二互补区互补配对形成双链的茎状部分，所述环形区的两端分别连接所述第一互补区和所述第二互补区连接形成单链的环状部分。
3.根据权利要求2所述检测体系，其特征在于，所述退火处理的反应体系包括退火缓冲液、所述底物片段和无酶水。
4.根据权利要求3所述检测体系，其特征在于，所述退火处理的反应程序为：98℃，持续1分钟；以每分钟下降1℃的速率降至25℃；25℃保存。
5.根据权利要求1所述检测体系，其特征在于，还包括缓冲液、氯化镁溶液、rna酶抑制剂、检测crrna和探针。
【专利技术属性】
技术研发人员：刘家兴，周钟琪，刘航程，许美景，
申请(专利权)人：厦门腾基医疗科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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