【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种无质粒合成3-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌的构建及应用，属于微生物代谢工程。
技术介绍
1、母乳作为营养的黄金标准，在生命早期发挥着不可替代的作用，具有长期的健康益处。人乳寡糖(hmos)占母乳干重的11-17％，是除乳糖和脂肪之外的第三大固体成分。作为生物活性低聚糖，hmos可以影响免疫系统、肠道微环境和大脑发育，保护婴儿免受有害细菌和病毒等机会性病原体的入侵。3-岩藻糖基乳糖(3-fl)和2-岩藻糖基乳糖(2′-fl)是hmos中具有代表性的异构体。它们分别与α-1，3葡萄糖和α-1，2半乳糖单位有关，而3-fl的总含量约占2′-fl的六分之一。越来越多的证据表明，3-fl具有多维的生理作用，包括改善肠道屏障功能，调节有益细菌的丰度，促进抗炎反应，降低病毒感染风险。与其他hmo不同，3-fl和3′-唾液酸乳糖(3′-sl)的浓度随着哺乳过程而增加。认识到3-fl对婴儿健康的重要性，配方奶粉制造商正在逐渐将其引入奶粉或功能产品中，以满足不断变化的婴儿发育需求。
2、目前，3-岩藻糖基乳糖可以通过化学法、酶法催化法合成以及微生物发酵法生产。化学法合成3-岩藻糖基乳糖涉及到复杂的生产条件且步骤严苛繁冗，并且原料成本较高；酶法合成虽温和可控,可较快的获得目标产物，但鉴于合成前体物质的价格高昂，使得生产成本较高。相比之下，代谢工程策略为3-fl的合成提供了高性能的方法，并衍生出许多高效的工程微生物，如大肠杆菌和酿酒酵母，以促进和提高hmos的生产率。
3、在3-岩藻糖基乳糖的生产过程中，ɑ-1,3-
技术实现思路
1、为了解决目前已报道的α-1,3-岩藻糖基转移酶及其在微生物发酵产物中产率不理想，生产滴度不高，生产过程中需要添加质粒，添加抗生素的问题，本专利技术提供了一种重组菌，所述重组菌可通过无质粒无抗生素合成的方式高效转化乳糖生产3-岩藻糖基乳糖且不存在其他岩藻糖基化母乳寡糖产生，便于下游的分离纯化工作。
2、本专利技术的第一个目的是提供了一株重组菌，所述重组菌以大肠杆菌为出发菌株，敲除了出发菌株基因组中的udp-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因wcaj，β-半乳糖苷酶编码基因lacz；以启动子pj23119启动出发菌株基因组上mana、manc、manb、gmd和wcag基因的表达；并分别在出发菌株基因组的arsb、ldha、poxb和manxyz位点整合表达了来源于neobacilluscucumis的α-1,3-糖基转移酶。
3、在一种实施方式中，以启动子pj23119调控所述α-1,3-糖基转移酶的编码基因fut3bc的表达。
4、在一种实施方式中，所述α-1,3-糖基转移酶编码基因fut3bc的核苷酸序列如seqid no.1所示。
5、在一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶的氨基酸序列的ncbi登录号为np_414878.1，所述udp-葡萄糖脂质载体转移酶的氨基酸序列的ncbi登录号为np_416551.1。
6、在一种实施方式中，所述基因mana、manc、manb、gmd和wcag的核苷酸序列分别如seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6所示。
7、在一种实施方式中，所述启动子pj23119的核苷酸序列如seq id no.7所示。
8、在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于大肠杆菌bl21(de3)。
9、本专利技术的第二个目的是提供了一种生产3-岩藻糖基乳糖的方法，所述方法包括：以所述重组菌为发酵菌株，发酵生产3-岩藻糖基乳糖。
10、在一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：
11、(1)将所述重组菌接种于种子培养基，培养，获得种子液；
12、(2)将步骤(1)所得种子液接种于发酵培养基，培养至od600为2～3，向培养体系中加入乳糖，于20～30℃发酵生产3-岩藻糖基乳糖。
13、在一种实施方式中，所述发酵培养基含有甘油。
14、在一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：
15、(1)将所述重组菌接种于种子培养基，培养，获得种子液；
16、(2)将步骤(1)所得种子液接种于发酵培养基，培养至od600为20～30，向培养体系中加入乳糖，于20～30℃发酵生产3-岩藻糖基乳糖。
17、在一种实施方式中，所述发酵的溶氧为20～50％，可选的，所述溶氧为30％。
18、在一种实施方式中，所述发酵的ph为6～7，可选择的，所述ph为6.5～6.7。
19、在一种实施方式中，通过向发酵体系中流加氨水维持发酵体系ph。
20、在一种实施方式中，所述发酵培养基中含有甘油，通过补料维持发酵体系中甘油浓度为1～5g/l。
21、在一种实施方式中，通过补料维持发酵体系中乳糖含量为1～5g/l。
22、本专利技术的第三个目的是提供所述重组菌，或所述方法在食品或医药领域中的应用。
23、在一种实施方式中，所述应用包括：将所述重组菌，或所述方法用于生产3-岩藻糖基乳糖或含有3-岩藻糖基乳糖的产品。
24、有益效果：
25、(1)本专利技术构建得到的重组菌株b2p5f能够高效生产3-岩藻糖基乳糖，在5l发酵罐中3-岩藻糖基乳糖60h产量达到了28.13g/l，产率为0.54g/l/h，显著高于现有技术。
26、(2)本专利技术的重组菌株b2p5f发酵生产3-岩藻糖基乳糖时，产物单一，未检测到其他岩藻糖基化产物形成。本专利技术的菌株能够避免底物浪费，有效节约成本，同时，避免了产物分离纯化困难，有效简化了下游分离步骤，更适宜于工业推广应用。
27、(3)本专利技术的重组菌株b2p5f为组成型整合表达，不需要诱导剂进行诱导，也不需要添加抗生素，可有效避免诱导剂和抗生素的添加对产物的污染，增加了重组菌的应用场景，并且节约了抗生素以及诱导剂的成本，能够促进微生物生产3-岩藻糖基乳糖的产业化应用。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一株重组菌，其特征在于，所述重组菌以大肠杆菌为出发菌株，敲除了出发菌株基因组中的UDP-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因wcaJ，β-半乳糖苷酶编码基因lacZ；以启动子PJ23119启动出发菌株基因组上manA、manC、manB、gmd和wcaG基因的表达；并分别在出发菌株基因组的arsB、ldhA、poxB和manXYZ位点整合表达了来源于Neobacillus cucumis的编码α-1,3-糖基转移酶的基因；以启动子PJ23119调控所述α-1,3-糖基转移酶编码基因的表达。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述α-1,3-糖基转移酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述UDP-葡萄糖脂质载体转移酶和β-半乳糖苷酶的登录号分别为NP_416551.1和NP_414878.1；所述基因manA、manC、manB、gmd和wcaG的核苷酸序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示；所述启动子PJ23119的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示
3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述出发菌株包括大肠杆菌BL21(DE3)。
4.一种生产3-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，所述方法包括：以权利要求1-3任一所述的重组菌为发酵菌株，发酵生产3-岩藻糖基乳糖。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵体系中含有甘油和乳糖，通过补料维持所述甘油和乳糖的浓度为1～5g/L。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵的pH为6～7。
9.权利要求1-3任一所述的重组菌，或权利要求4-8任一所述的方法在食品或化工领域中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述重组菌，或所述方法用于生产3-岩藻糖基乳糖或含有3-岩藻糖基乳糖的产品。
...【技术特征摘要】
1.一株重组菌，其特征在于，所述重组菌以大肠杆菌为出发菌株，敲除了出发菌株基因组中的udp-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因wcaj，β-半乳糖苷酶编码基因lacz；以启动子pj23119启动出发菌株基因组上mana、manc、manb、gmd和wcag基因的表达；并分别在出发菌株基因组的arsb、ldha、poxb和manxyz位点整合表达了来源于neobacillus cucumis的编码α-1,3-糖基转移酶的基因；以启动子pj23119调控所述α-1,3-糖基转移酶编码基因的表达。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述α-1,3-糖基转移酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述udp-葡萄糖脂质载体转移酶和β-半乳糖苷酶的登录号分别为np_416551.1和np_414878.1；所述基因mana、manc、manb、gmd和wcag的核苷酸序列分别如seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6所示；所述启...
【专利技术属性】
技术研发人员：沐万孟，朱莺莺，陈逸晗，陈柔霖，杜智慧，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。