【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及几种高效再生gtp的多聚磷酸激酶及其应用，属于生物。
技术介绍
1、核苷三磷酸(ntp)是细胞内能量转移和储存的重要分子，并参与体内的各种生化反应，具有重要作用。核苷三磷酸代谢过程在物种间是相当保守的，因此通常核苷三磷酸盐是从头合成的。gtp是三羧酸循环中琥珀酸辅酶a转变为琥珀酸过程中的能量载体，它可以和atp相互转换。同时gtp对神经、代谢和心血管等有重要的作用。目前，gtp合成是通过发酵法及酶法，利用一系列酶来进行反应合成的。所以，gtp价格仍然较为昂贵。而gtp在反应中通常被降解为gdp/gmp。因此，开发一种能够将gdp/gmp再转化为gtp的酶是十分有意义的。
2、多聚磷酸激酶(ppk)分为两种，最初从大肠杆菌中分离的ppk(现在命名为ppk1)可逆地催化atp的末端pi残基转移到短链多聚磷酸(polyp)上，生成长链polyp。ppk2与ppk1没有明显的序列相似性，优先催化polyp驱动的核苷酸磷酸化，需要金属离子激发活性。ppk2家族可分为三个亚家族(i类、ii类和iii类)，i类和ii类ppk2分别催化核苷二磷酸和核苷一磷酸磷酸化，iii类ppk2催化核苷单磷酸和核苷二磷酸磷酸化。而不同ppk2催化核苷二磷酸的偏好具有较大差异，并且大多数ppk只有在长链polyp存在的情况下才会活跃。
3、gdp-l-岩藻糖是存在于人体内的核苷酸类物质，也是生命活动不可缺少的物质。在临床应用中，gdp-l-岩藻糖用于治疗某些疾病，如慢性肝炎、进行性肌萎缩、视力减退等。此外，gdp-l-岩藻
4、对于ntp再生系统的研究，目前大都集中在adp再生atp上，关于gtp再生的研究报道还较少。因此，开发出能够利用大宗polyp再生gtp的新型ppk具有广泛的应用前景。
技术实现思路
1、针对gtp底物用途范围广但价格昂贵的问题，本专利技术提供几种高效再生gtp的ppk及其应用，这些ppk能够以polyp为底物再生gtp。
2、本专利技术所采用技术方案如下：
3、本专利技术提供几种ppk，其特征在于，所述ppk的氨基酸序列选自以下其中一种：
4、(1)如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3所示的氨基酸序列；
5、(2)对seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰且具有相同功能的氨基酸序列；
6、本专利技术还提供编码上述ppk的基因。优选地，所述ppk的核苷酸序列如seq idno.4、seq id no.5、seq id no.6所示。
7、本专利技术还提供了携带所述基因的重组质粒载体。优选地，所述重组表达载体为pet28a(+)。
8、本专利技术还提供包含上述重组质粒载体的重组微生物。优选地，所述重组微生物为大肠杆菌bl21(de3)。
9、本专利技术还提供所述的ppk利用聚磷酸盐在gtp再生，gdp-l-岩藻糖或gdp-甘露糖及其衍生产品合成中的应用。
10、在本专利技术的一个实施方式中，所述聚磷酸盐供体，优选为三聚磷酸盐、四聚磷酸盐和六偏磷酸盐中的一种。
11、在本专利技术的一个实施方式中，首先，利用gdp-l-岩藻糖合成相关酶在体外多酶级联催化合成gdp-l-岩藻糖，之后联合岩藻糖基转移酶催化gdp-l-岩藻糖和乳糖生产岩藻糖基乳糖。
12、在本专利技术的一个实施方式中，几种ppk被用于再生gtp，并合成gdp-l-岩藻糖及岩藻糖基乳糖。
13、在本专利技术的一个实施方式中，所述gdp-l-岩藻糖从头合成相关酶选自来源于arthrobacter species的葡萄糖甘露糖激酶(ppgmk)、来源于streptomyces coelicolor的磷酸甘露糖变位酶(manb)、来源于大肠杆菌的甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶(manc)、来源于pseudomonas aeruginosa pao1的gdp-d-甘露糖-4，6-水合酶(gmd)、来源于helicobacterpylori的gdp-l-岩藻糖合酶(wcag)。
14、在本专利技术的一个实施方式中，所述gdp-l-岩藻糖补救合成相关酶。优选为来自脆弱拟杆菌的l-岩藻糖激酶/gdp-l-岩藻糖焦磷酸化酶(fkp)。
15、在本专利技术的一个实施方式中，所述岩藻糖基转移酶为α-1,2-岩藻糖基转移酶或α-1,3-岩藻糖基转移酶中的一种，优选的来源为helicobacter pylori。
16、在本专利技术的一个实施方式中，几种ppk被用于再生gtp，并合成gdp-l-岩藻糖及岩藻糖基乳糖。其反应体系中含有0.1-2mg/ml gdp-l-岩藻糖从头合成相关酶、0.1-2mg/ml岩藻糖基转移酶、0.1-2mg/ml ppk、1-50mm甘露糖、1-50mm乳糖、1-50mm polyp、1-10mm gtp或gdp、1-50mm nadph或nadp+，反应ph 6-10，反应温度20-40℃，反应时间1-48h。
17、在本专利技术的一个实施方式中，几种ppk被用于再生gtp，并合成gdp-l-岩藻糖及岩藻糖基乳糖。其反应体系中含有0.1-2mg/ml gdp-l-岩藻糖补救合成相关酶、0.1-2mg/ml岩藻糖基转移酶、0.1-2mg/ml ppk、1-50mm岩藻糖、1-50mm乳糖、1-50mm polyp、1-10mm gtp或gdp，1-10mm atp或adp，反应ph 6-10，反应温度20-40℃，反应时间1-48h。
18、本专利技术的有益效果：
19、目前对于ntp再生系统的研究，大都集中在adp再生atp上，关于gtp再生的研究报道还较少。本专利技术提供了一种低成本、高效再生gtp的方法，涉及的几种ppk能够以大宗的polyp为原料，高效再生gtp，具有广泛的应用前景。
20、本专利技术将几种ppk用于gtp再生，通过体外级联gdp-l-岩藻糖合成相关酶和岩藻糖基转移酶，成功合成gdp-l-岩藻糖及岩藻糖基乳糖。以20mm((6.84g/l)的乳糖和2mm gtp，体外一锅法反应48h，2′-fl产量达到5.93g/l。本专利技术实现了绿色、高效的gdp-l-岩藻糖及岩藻糖基乳糖的体外合成。本专利技术对gtp再生、gdp-l-岩藻糖或gdp-甘露糖及其衍生产品的合成具有广泛的应用前景。
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1.几种高效再生GTP的多聚磷酸激酶及其应用，其特征在于，所述多聚磷酸激酶((PPK)的氨基酸序列选自以下其中一种：
2.几种PPK基因，其特征在于：所述基因编码权利要求1所述的PPK。
3.携带权利要求2所述基因的重组质粒载体。
4.根据权利要求3所述的重组质粒载体，其特征在于，所述质粒包括但不限于pET28a(+)。
5.表达权利要求1所述PPK的重组微生物。
6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物为大肠杆菌BL21(DE3)。
7.权利要求1所述的PPK利用聚磷酸盐在GTP再生，GDP-L-岩藻糖或GDP-甘露糖及其衍生产品合成中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，首先，利用GDP-L-岩藻糖合成相关酶在体外多酶级联催化合成GDP-L-岩藻糖，之后联合岩藻糖基转移酶催化GDP-L-岩藻糖和乳糖生产岩藻糖基乳糖，还加入权利要求1所述的PPK再生GTP用于合成GDP-L-岩藻糖及岩藻糖基乳糖。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，反应体系
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，反应体系中含有0.1-2mg/mL GDP-L-岩藻糖补救合成相关酶、0.1-2mg/mL岩藻糖基转移酶、0.1-2mg/mL PPK、1-50mM岩藻糖、1-50mM乳糖、1-50mM polyP、1-10mM GTP或GDP，1-10mM ATP或ADP，反应pH 6-10，反应温度20-40℃，反应时间1-48h。
...【技术特征摘要】
1.几种高效再生gtp的多聚磷酸激酶及其应用，其特征在于，所述多聚磷酸激酶((ppk)的氨基酸序列选自以下其中一种：
2.几种ppk基因，其特征在于：所述基因编码权利要求1所述的ppk。
3.携带权利要求2所述基因的重组质粒载体。
4.根据权利要求3所述的重组质粒载体，其特征在于，所述质粒包括但不限于pet28a(+)。
5.表达权利要求1所述ppk的重组微生物。
6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物为大肠杆菌bl21(de3)。
7.权利要求1所述的ppk利用聚磷酸盐在gtp再生，gdp-l-岩藻糖或gdp-甘露糖及其衍生产品合成中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，首先，利用gdp-l-岩藻糖合成相关酶在体外多酶级联催化合成gdp-l-岩藻糖，之后联合岩藻糖基转移酶催化gdp-l-岩藻糖和乳糖生产岩藻糖基乳糖...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘珞，曹晨琦，吴林博，王睿楷，刘晨媛，蒋林彤，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：
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