【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸检测，具体涉及一种草莓马铃薯卷叶病毒1的快速检测方法及其应用。
技术介绍
1、草莓马铃薯卷叶病毒1(strawberry polerovirus 1,spv1)隶属南方菜豆花叶病毒科马铃薯卷叶病毒属，基因组为正单链rna，由1条长度为5986nt的rna组成，预测编码6个蛋白。2015年，加拿大东部地区的草莓中发现了病毒spv1；2016年，美国地区报道了草莓中携带病毒spv1；2017年，阿根廷地区报道了草莓中携带spv1病毒；2022年，在尼泊尔地区草莓中发现病毒spv1。目前，国内尚未见病毒spv1的报道。有报道称该病毒能引起草莓衰退，对草莓生产将造成经济损失。
2、日本学者notomi在2000年提出了环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，lamp)技术，具有特异性强、操作简单及扩增高效等优点。基于lamp技术的逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermalamplification，rt-lamp)是在反应体系中加入逆转录酶实现对rna模板的一步扩增。该技术已被广泛应用到其它病毒的检测中，目前，尚未见rt-lamp技术检测spv1的报道。病毒spv1的检测手段主要是通过高通量测序结合rt-pcr方法。这种方法耗时久、仪器昂贵，通常无法通过裸眼直观判定。因此，开发操作简便、耗时短，且能够裸眼直观判定的检测方法十分必要。
技术实现思路p>
1、本专利技术的主要目的是提出一种草莓马铃薯卷叶病毒1的快速检测方法及其应用，旨在提供一种特异性强、灵敏度高、操作简单、仪器成本低且鉴定结果直观的草莓马铃薯卷叶病毒1的rt-lamp检测方法。
2、为实现上述目的，本专利技术提出一种草草莓马铃薯卷叶病毒1的快速检测方法，所述检测方法以草莓马铃薯卷叶病毒1的p3-p5融合蛋白编码基因为靶标序列设计引物，利用所述引物进行逆转录环介导等温扩增鉴定草莓马铃薯卷叶病毒1。
3、可选地，所述引物包括spv1-f3引物、spv1-b3引物、spv1-fip引物、spv1-bip引物和spv1-lb引物，其具体序列如下：
4、spv1-f3：ggtagatccggcgctatc；
5、spv1-b3：acaagcctgagaaaccaaat；
6、spv1-fip：cgagtacgatgacaacccgcggtcggtgtcaca aattcc；
7、spv1-bip：cagatgctcgtttacggtacgtaccgctgaaga aacaaacc；
8、spv1-lb：caacagggatctgatcggactg。
9、可选地，所述检测方法包括以下步骤：
10、s1、提取待测生物样本的总rna；
11、s2、以所述总rna为模板，用包含如上所述的引物进行逆转录环介导恒温扩增，得到扩增产物；
12、s3、根据所述扩增产物鉴定所述待测生物样本是否含有草莓马铃薯卷叶病毒1或者是否被草莓马铃薯卷叶病毒1侵染。
13、可选地，在步骤s3中，所述鉴定采用下述1)或2)所述的方法：
14、1)所述扩增产物中加入0.3μl荧光染料sybr green i，裸眼直接观察颜色变化，含有病毒spv1的样品会被染成绿色，不含病毒spv1的样品呈现橙色；
15、2)常规的琼脂糖凝胶电泳和紫外成像观察，含有病毒spv1的样品能形成瀑布型条带。
16、可选地，所述逆转录环介导等温扩增采用的反应体系为2.5μl 10×isothermalamplification buffer、8mmol/l mg2+、1mmol/l dntps、1μmol/l spv1-fip和spv1-bip，0.1μmol/l spv1-f3和spv1-b3，0.1μmol/l spv1-lb，0.4mmol/l betaine，1μl warmstart bst2.0dna polymerase，0.2μl warmstart rtx reverse transcriptase，1μl模板rna，加入ddh2o补足25μl。
17、可选地，所述逆转录环介导等温扩增采用的反应程序为60℃，30min；80℃，10min。
18、本专利技术还提出如上所述的草莓马铃薯卷叶病毒1的快速检测方法在制备检测草莓马铃薯卷叶病毒1的试剂盒中的应用。
19、本专利技术的有益效果在于：
20、(1)本专利技术提供的草莓马铃薯卷叶病毒1的快速检测方法检测时间短，操作简单、特异性强、灵敏度高、仪器成本低，鉴定结果直观。
21、(2)本专利技术针对病毒spv1提出了一种快速检测方法，采用rt-lamp扩增技术，可在40min内完成扩增检测，操作简单，且通过荧光染料sybr green i染色后，直接裸眼观察鉴定结果，鉴于该检测方法的直观性，可将其应用于草莓马铃薯卷叶病毒1检测试剂盒中，方便快捷。
22、(3)本专利技术通过对常规的rt-lamp的反应条件进行优化，在本专利技术优化条件下进行扩增反应，能够快速得到反应结果，节省原料成本。
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1.一种草莓马铃薯卷叶病毒1的快速检测方法，其特征在于，所述检测方法以草莓马铃薯卷叶病毒1的P3-P5融合蛋白编码基因为靶标序列设计引物，利用所述引物进行逆转录环介导等温扩增鉴定草莓马铃薯卷叶病毒1。
2.如权利要求1所述的草莓马铃薯卷叶病毒1的快速检测方法，其特征在于，所述引物包括SPV1-F3引物、SPV1-B3引物、SPV1-FIP引物、SPV1-BIP引物和SPV1-LB引物，其具体序列如下：
3.如权利要求2所述的草莓马铃薯卷叶病毒1的快速检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的草莓马铃薯卷叶病毒1的快速检测方法，其特征在于，在步骤S3中，所述鉴定采用下述1)或2)所述的方法：
5.如权利要求1所述的草莓马铃薯卷叶病毒1的快速检测方法，其特征在于，所述逆转录环介导等温扩增采用的反应体系为2.5μL 10×Isothermal Amplification Buffer、8mmol/L Mg2+、1mmol/L dNTPs、1μmol/L SPV1-FIP和SPV1-BIP，0.1μmol/L
6.如权利要求1所述的草莓马铃薯卷叶病毒1的快速检测方法，其特征在于，所述逆转录环介导等温扩增采用的反应程序为60℃30min，80℃10min。
7.如权利要求1至6任一项所述的草莓马铃薯卷叶病毒1的快速检测方法在制备检测草莓马铃薯卷叶病毒1的试剂盒中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种草莓马铃薯卷叶病毒1的快速检测方法，其特征在于，所述检测方法以草莓马铃薯卷叶病毒1的p3-p5融合蛋白编码基因为靶标序列设计引物，利用所述引物进行逆转录环介导等温扩增鉴定草莓马铃薯卷叶病毒1。
2.如权利要求1所述的草莓马铃薯卷叶病毒1的快速检测方法，其特征在于，所述引物包括spv1-f3引物、spv1-b3引物、spv1-fip引物、spv1-bip引物和spv1-lb引物，其具体序列如下：
3.如权利要求2所述的草莓马铃薯卷叶病毒1的快速检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的草莓马铃薯卷叶病毒1的快速检测方法，其特征在于，在步骤s3中，所述鉴定采用下述1)或2)所述的方法：
5.如权利要求1所述的草莓马铃薯卷叶病毒1的快速检测方法，其特征在于，所述逆转录环介导等温扩增采用的反应体系为2.5μ...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩永超，王涌，曾祥国，肖桂林，邓江丽，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：
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