【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，具体涉及一种单通道双靶标数字pcr检测方法。
技术介绍
1、数字pcr(digital pcr，dpcr)，即第三代pcr技术，是近年逐渐发展并得到广泛应用的一种核酸定量分析技术。与初代传统pcr、第二代荧光定量pcr相比，数字pcr是将核酸样品分配到大量独立、平行的微反应单元(nl，纳升级别)中，使得每个反应单元中尽可能含有1个模板分子，并在此基础上进行扩增、检测和分布统计，对结果的判定可以不依赖标准曲线，避免了pcr抑制剂及不同核酸分子扩增产物间的相互干扰，可实现对靶标分子的绝对计数。
2、目前市面上常见的dpcr主要有两种：微滴式dpcr(droplet dpcr，ddpcr)和芯片式dpcr(chip dpcr，cdpcr)技术。无论两种技术路线，主要都是通过不同的检测通道来区分靶标基因，常见的检测通道有fam、hex、rox、atto、cy5、cy5.5等。在设计引物探针时，通过在探针的5′端添加与检测通道对应的荧光基团，在检测时就可根据荧光的颜色来判定不同的产物。
3、通常为了降低检测成本，并获取更丰富的检测信息，在dpcr中会进行多指标的并行检测，不同于qpcr中的多腔室扩增与多荧光通道结合的并行pcr方式，在dpcr里，一个微反应腔室里一般只含一种靶基因，所以dpcr的多指标检测主要通过以下两种方式实现：1)多个荧光通道。使用不同的荧光基团标记不同的探针，一般最多为六色检测通道，包含fam、hex、atto、rox、cy5和cy5.5。当检测到靶表基因而使荧光基团被
4、目前数字pcr检测为单通道针对单靶标基因进行检测，具有检测通量低、检测成本高、检测时间长等缺点。
技术实现思路
1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种单通道双靶标数字pcr检测方法，以期解决现有技术中存在的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术具体采用如下技术方案。
3、本专利技术保护一种单通道双靶标数字pcr检测方法，包括如下步骤：
4、1)构建混合pcr反应体系，所述混合pcr反应体系中包括第一靶标引物、第一靶标探针、第二靶标引物、第二靶标探针，其中，
5、所述第一靶标探针与所述第二靶标探针的荧光报告基团相同，所述第一靶标探针与所述第二靶标探针浓度不同，以使第一靶标探针单独显色对应的第一荧光值a、第二靶标探针单独显色对应的第二荧光值b以及第一靶标探针与第二靶标探针共同显色对应的第三荧光值c能分层显示；
6、2)将样本采用1)中的所述混合pcr反应体系进行数字pcr反应，基于所述第一靶标探针发出的第一荧光信号得到第一拷贝数x1，基于所述第二靶标探针发出的第二荧光信号得到第二拷贝数x2，基于所述第一靶标探针与所述第二靶标探针共同显色发出的第三荧光信号得到第三拷贝数x3，以所述第一拷贝数x1与所述第三拷贝数x3之和确定所述样本中第一靶标的浓度，以所述第二拷贝数x2与所述第三拷贝数x3之和确定所述样本中第二靶标的浓度。
7、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
8、1)本专利技术的单通道双靶标数字pcr检测方法通过调整探针的序列设计以及探针在混合pcr反应体系中的浓度，在单通道内实现了两个靶标基因的检测，保持了与单通道单靶标基因检测相同的特异性、准确性。
9、2)本专利技术的单通道双靶标数字pcr检测方法，使用更少量的试剂和检测材料，能节省样本、时间、试剂及成本。
10、3)本专利技术的单通道双靶标数字pcr检测方法可实现多靶标检测，实现了利用有限的荧光通道数对微量或痕量dna的尽可能多的靶标基因的同步检测，提升了检测的效率和通量。
11、4)本专利技术的单通道双靶标数字pcr检测方法，能实现在单通道显示三重阳性荧光检测结果；在6个荧光通道的基础上，可得到共18重结果；实现了单个芯片上可显示18重阳性荧光检测结果的功能，有利于dpcr进行高通量检测。
12、5)本专利技术的单通道双靶标数字pcr检测方法、多靶标数字pcr检测方法，突破了数字pcr检测平台中六个荧光通道中只能对六个待检基因位点的限制，通过计算和分析混合pcr体系中探针间形成二级结构和二聚体的能力以及探针的最佳添加浓度等，使这一混合pcr体系能够实现有限的荧光通道数检测尽量多的待检靶标，进一步提升了检测的效率和通量。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种单通道双靶标数字PCR检测方法，其特征在于，包括下列步骤：
2.如权利要求1所述的单通道双靶标数字PCR检测方法，其特征在于，所述第一荧光值A与所述第二荧光值B的差值不小于50；优选的，所述第一荧光值A小于所述第二荧光值B，且所述第二荧光值B为100～200；优选的，所述第一荧光值A为20～110；
3.如权利要求3所述的单通道双靶标数字PCR检测方法，其特征在于，以混合PCR反应体系的总体积为基准计，所述第一靶标探针的浓度为10～80nM；
4.如权利要求1所述的单通道双靶标数字PCR检测方法，其特征在于，所述第一靶标和第二靶标的长度为50～150bp；
5.如权利要求1-4任一项所述的单通道双靶标数字PCR检测方法在检测多靶标中的用途。
6.一种多靶标数字PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.一种单通道双靶标数字PCR检测组合物，其特征在于，包括第一靶标引物、第一靶标探针、第二靶标引物、第二靶标探针，其中，
8.如权利要求7所述的单通道双靶标数字PCR检测组合物，其特征在于，
9.如权利要求7所述的单通道双靶标数字PCR检测组合物，其特征在于，第一靶标和第二靶标各自独立的选自ITS2、NUC、28S、ASA1、LBD、B2M、ITS、ORF2、SesB和ITS中的一种或多种；优选的，所述ITS2来源于光滑念珠菌，所述NUC来源于人葡萄球菌，所述28S来源于念珠菌属，所述ASA1来源于粪肠球菌，所述LBD来源于拟南芥，所述B2M来源于人基因组，所述ITS来源于白色念珠菌，所述ORF2来源于诺如病毒，所述SesB来源于表皮葡萄球菌，所述ITS来源于近平滑念珠菌。
10.如权利要求9所述的单通道双靶标数字PCR检测组合物，其特征在于，针对光滑念珠菌ITS2设计的引物探针包含如SEQ ID No.57所示序列的探针以及如SEQ ID No.55和SEQIDNo.56所示序列的引物对；
11.如权利要求7～10所述的单通道双靶标数字PCR检测组合物在制备检测多靶标的试剂盒中的用途。
12.一种多靶标检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含若干组如权利要求7～10任一项所述的单通道双靶标数字PCR检测组合物，且不同组的单通道双靶标数字PCR检测组合物之间的探针标记不同的荧光报告基团。
...【技术特征摘要】
1.一种单通道双靶标数字pcr检测方法，其特征在于，包括下列步骤：
2.如权利要求1所述的单通道双靶标数字pcr检测方法，其特征在于，所述第一荧光值a与所述第二荧光值b的差值不小于50；优选的，所述第一荧光值a小于所述第二荧光值b，且所述第二荧光值b为100～200；优选的，所述第一荧光值a为20～110；
3.如权利要求3所述的单通道双靶标数字pcr检测方法，其特征在于，以混合pcr反应体系的总体积为基准计，所述第一靶标探针的浓度为10～80nm；
4.如权利要求1所述的单通道双靶标数字pcr检测方法，其特征在于，所述第一靶标和第二靶标的长度为50～150bp；
5.如权利要求1-4任一项所述的单通道双靶标数字pcr检测方法在检测多靶标中的用途。
6.一种多靶标数字pcr检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.一种单通道双靶标数字pcr检测组合物，其特征在于，包括第一靶标引物、第一靶标探针、第二靶标引物、第二靶标探针，其中，
8.如权利要求7所述的单通道双靶标数字pcr检测组合物，其特征在于，所述第一荧光值a与所述第二荧光值b的差值不小于50；优选的，所述第一荧光值a小于所述第二荧光值b，且所述第二荧光值b为10...
【专利技术属性】
技术研发人员：闵冉洁，
申请(专利权)人：臻准生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。