【技术实现步骤摘要】
本申请涉及海水养殖，更具体地说，它涉及一种溶藻菌的制备方法及其应用。
技术介绍
1、海水养殖过程中会产生大量高盐度且含有氮、磷营养物质的废水。海水养殖废水的无序排放会导致水体富营养化，加剧水环境污染，对生态系统健康造成严重的威胁。海水养殖废水的碳氮比较低，在实际低碳氮比污水的脱氮处理中，生物反硝化往往会因碳源不足而导致脱氮效果较差，通常需要补充有机碳源来满足异养反硝化的需求。
2、赤潮藻的有机质含量高，是厌氧发酵的理想底物。通过厌氧发酵，可以将藻中的有机质转化为挥发性脂肪酸(vfas)。vfas可以作为城市污水处理厂脱氮除磷的碳源。但藻的细胞壁阻碍有机质从细胞中分离出来，使得发酵微生物可利用的底物少，从而影响赤潮藻厌氧发酵产酸的效率.因此，强化藻细胞破壁是赤潮藻厌氧发酵产酸需要解决的问题。
3、近年来，随着对藻与菌之间关系研究的深入，发现某些细菌能够杀灭或溶解微藻，这类细菌被称之为溶藻细菌。溶藻菌能够通过裂解藻的细胞结构起到溶解藻类的效果，是赤潮藻破壁预处理较为适宜的方法。基于此，通过溶藻细菌对赤潮藻进行预处理，强化赤潮藻厌氧发酵产酸性能，并将赤潮藻厌氧发酵产酸的产物作为反硝化脱氮的碳源，既可以实现赤潮藻的资源化利用，又可以降低碳源成本，变“废”为“宝”，具有广阔前景。
技术实现思路
1、本公开提供了一种溶藻菌的制备方法及其应用，藻厌氧产酸发酵液作为海水养殖废水反硝化外加碳源时脱氮效果。
2、第一方面，本公开提供一种溶藻菌的制备方法，包括以下步骤
3、(1)溶藻菌的筛选：取适量沉积物样品加入到无菌2216e液体培养基中，在25℃，120r/min条件下以进行富集培养，在超净工作台中取富集好的培养液，用0.9％无菌生理盐水稀释成不同的浓度梯度，取50μl稀释的富集液均匀涂布在2216e固体培养基上，将所述富集液倒置于25℃恒温培养箱中培养，直至菌落形成；
4、(2)溶藻菌的分离：选择形态、大小、颜色不同的菌落进行划线分离；
5、(3)溶藻菌的纯化：采用所述步骤2)的方法分离纯化三次，确保菌株纯度，将纯化后的单菌落挑至无菌的2216e液体培养基中，在震荡培养箱中培养得到液体细菌培养物，将菌液添加到50％冷冻培养基中，在超低温冰箱中冷冻保存，实验前将菌株活化，以2％接种量接入新鲜无菌2216e，液体培养基中，温度25℃，转速120r/min，培养；
6、(4)共分离到15株细菌，其中4株对太平洋亚历山大藻具有溶藻活性，在4株溶藻菌株中，选择具有最高的溶藻活性菌株y1。
7、优选的，步骤1)中进行富集培养的时间为70-72h。
8、优选的，所述2216e培养基包括蛋白胨、酵母提取物、磷酸高铁、琼脂粉和陈海水，所述2216e培养基的含量为蛋白胨3-5g，酵母提取物0.5-1g，磷酸高铁0.1-0.2g，琼脂粉10-12g，陈海水1l-1.5l。
9、优选的，所述2216e培养基的ph＝7.6-7.8。
10、优选的，步骤3)中，培养时间为20-24h。
11、第二方面，本公开提供一种溶藻菌的应用，所述溶藻细菌y1应用于太平洋亚历山大藻中。
12、优选的，所述应用方法具体包括：将所述y1细菌培养液、无菌滤液和菌体重悬液分别添加到处于对数生长期藻液中，在添加菌体重悬液组与添加细菌培养液组和滤液组的溶藻率表现出显著差异(p<0.05)，在48h培养时间内，溶藻率范围在-0.58±5.37％到24.49±6.37％之间波动变化。
13、优选的，所述溶藻菌对藻的发酵效果的强化为：将加入所述溶藻细菌y1滤液处理24h的藻液，离心浓缩后，进行厌氧发酵。
14、优选的，体应用包括以下步骤：
15、s1：在稳定运行的用于海水养殖废水处理的厌氧好氧移动床生物膜反应器a/o-mbbr的进水中投加藻的厌氧产酸发酵液以强化脱氮效果；
16、s2：a/o-mbbr反应器有效容积为8l，水力停留时间为8h，海水养殖废水投加nh4cl、nano2和nano3以控制海水养殖废水各指标浓度为nh4+-n4.7mg·l-1、no2--n0.6mg·l-1和no3--n4.9mg·l-1；
17、s3：分别投加乙酸钠和经过溶藻细菌y1厌氧产酸发酵液作为碳源来控制进水的cod浓度为160mg·l-1，间隔取样测定氮的去除效率的变化。
18、综上所述，本申请具有以下有益效果：
19、1、本申请中添加溶藻细菌y1的太平洋亚历山大藻发酵液中的乙酸含量明显升高。在生物脱氮系统中，vfas中的乙酸被认为是最佳的碳源。因此，添加溶藻细菌y1不仅促进了vfas产量的增加，还提升了其发酵产物的利用价值。
20、2、本申请中溶藻细菌y1滤液能破坏太平洋亚历山大藻细胞膜完整性；
21、3、本申请以藻厌氧产酸发酵液作为碳源时，no3--n的去除效率更高(85.5％)。且两种额外碳源的添加均没有no2--n的积累。当不外加碳源时，no3--n的去除率仅为45.7％。结果表明藻发酵液可以作为强化反硝化脱氮的碳源。
22、应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本公开的保护范围。
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1.一种溶藻菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述溶藻菌的制备方法，其特征在于，步骤1)中进行富集培养的时间为70-72h。
3.根据权利要求2所述溶藻菌的制备方法，其特征在于，2216E培养基包括蛋白胨、酵母提取物、磷酸高铁、琼脂粉和陈海水，所述2216E培养基的含量为蛋白胨3-5g，酵母提取物0.5-1g，磷酸高铁0.1-0.2g，琼脂粉10-12g，陈海水1L-1.5L。
4.根据权利要求3所述溶藻菌的制备方法，其特征在于，所述2216E培养基的pH=7.6-7.8。
5.根据权利要求1所述的溶藻菌的制备方法，其特征在于，步骤3）中，培养时间为20-24h。
6.根据权利要求1-5任意一项制备的所述溶藻菌的应用，其特征在于，所述溶藻菌应用于太平洋亚历山大藻中。
7.根据权利要求6所述溶藻菌的应用，其特征在于，所述应用方法具体包括：将Y1细菌培养液、无菌滤液和菌体重悬液分别添加到处于对数生长期藻液中，在添加菌体重悬液组与添加细菌培养液组和滤液组的溶藻率表现出显著差异（P<0
8.根据权利要求6所述溶藻菌的应用，其特征在于，所述溶藻菌对藻的发酵效果的强化为：将加入所述溶藻细菌Y1滤液处理24h的藻液，离心浓缩后，进行厌氧发酵。
9.根据权利要求6所述溶藻菌的应用，其特征在于，具体应用包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种溶藻菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述溶藻菌的制备方法，其特征在于，步骤1)中进行富集培养的时间为70-72h。
3.根据权利要求2所述溶藻菌的制备方法，其特征在于，2216e培养基包括蛋白胨、酵母提取物、磷酸高铁、琼脂粉和陈海水，所述2216e培养基的含量为蛋白胨3-5g，酵母提取物0.5-1g，磷酸高铁0.1-0.2g，琼脂粉10-12g，陈海水1l-1.5l。
4.根据权利要求3所述溶藻菌的制备方法，其特征在于，所述2216e培养基的ph=7.6-7.8。
5.根据权利要求1所述的溶藻菌的制备方法，其特征在于，步骤3）中，培养时间为20-24h。
6.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：李辉，相壮壮，闫文文，晨曦，陈田，白洁，苑伟伟，张国华，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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