【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别涉及一种γδt细胞的制备方法。
技术介绍
1、根据tcr的肽链表达不同，t细胞主要分为αβt细胞和γδt细胞，γδt细胞根据结构又可分为vδ1γδt细胞、vδ2γδt细胞和vδ3γδt细胞，其中vδ2γδt细胞分布于外周血中，占总γδt细胞数量的50%～90%。与αβt细胞相比，γδt细胞在人外周血中的占比较低，分离纯化相对困难，但γδt细胞对抗原的识别无mhc限制性，γδt细胞能够通过诱导凋亡、分泌细胞因子、释放颗粒酶与穿孔素等多种途径杀伤肿瘤细胞；还可增强脂多糖（lps）诱导的树突状细胞成熟，通过dc细胞抗原呈递功能，将肿瘤细胞抗原信息急速高效的呈递给其他t细胞，对多种癌症如结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、肺癌、卵巢癌和前列腺癌也表现出较好的抗肿瘤免疫效果，γδt细胞也逐渐成为细胞免疫治疗研究的一个新兴领域。
2、现有技术公开了培养γδt细胞的一些方法，但是仍然存在如下问题：
3、（1）细胞因子浓度过高，可能导致γδt细胞的过度激活和异常增殖，从而导致免疫系统过度活跃，引发自身免疫性疾病或炎症反应；
4、（2）使用胎牛血清可能存在动物源性成分的风险；
5、（3）磷酸类药物的应用剂量过高，周期过长，容易引起细胞毒性反应；
6、（4）培养周期较长，目前大部分常规培养方法培养周期在14至28天不等，不仅增加实验时间和成本，还可能导致细胞的老化和功能丧失。
7、因此，现有γδt细胞培养体系在科研阶段可广泛使用，但在临床或市场上的
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供的一种γδt细胞的制备方法，总培养周期为10天，使用抗tcr γδ单抗预先包被培养瓶联合唑来膦酸共同刺激外周血单核细胞，同时添加适当浓度的il-2、il-7、il-18、灭活自体血浆、dha等物质共同培养，克服了现有技术存在的问题，提供了一种制备周期短、纯度高、针对实体瘤具有较好杀伤效果的γδt细胞的方法。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了组合物，组成为抗tcrγδ抗体、il-2、il-7、il-18、唑来膦酸、灭活血浆和脱氢抗坏血酸。
4、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述组合物组成为抗人源tcrγδ抗体、人源il-2、人源il-7、人源il-18、唑来膦酸、灭活人源血浆和脱氢抗坏血酸。
5、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述组合物组成为抗人源tcrγδ抗体、人源il-2、人源il-7、人源il-18、唑来膦酸、灭活人源血浆、脱氢抗坏血酸、培养基和抗生素。
6、本专利技术还提供了上述组合物在如下任一项中的用途：
7、（i）、制备或培养γδt细胞；
8、（ii）、生产用于制备或培养γδt细胞的产品；
9、（iii）、生产预防或治疗肿瘤或癌症的产品；
10、（iv）、预防或治疗肿瘤或癌症。
11、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述用途的（ii）所述产品包括培养基、培养添加剂、培养试剂盒或培养装置。
12、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述用途的（iii）所述癌症包括结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、肺癌、卵巢癌或前列腺癌中的一种或多种。
13、本专利技术还提供了产品，包括培养基、培养添加剂、培养试剂盒或培养装置，包括上述组合物，以及可接受的辅料或助剂。
14、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述产品还包括培养基和/或抗生素。
15、本专利技术还提供了制备或培养γδt细胞的方法，基于上述组合物或上述产品培养。
16、本专利技术还提供了预防或治疗肿瘤或癌症的方法，所述癌症包括结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、肺癌、卵巢癌或前列腺癌中的一种或多种，步骤包括：采集患者血液，分离出外周血单个核细胞以及血浆，对血浆进行灭活获得灭活血浆，基于上述组合物或上述产品培养，获得γδt细胞，输入患者体内。
17、本专利技术还提供了培养γδt细胞的方法，包括如下步骤：
18、步骤（1）：取含抗tcrγδ抗体的包被液包被培养瓶，往培养瓶中加入含il-2、il-7和il-18的培养基，取外周血单个核细胞接入所述培养基，并加入唑来膦酸、灭活血浆，培养3～5天；
19、步骤（2）：将细胞接入新的含il-2、il-7和il-18的培养基，并加入灭活血浆，培养3～5天；
20、步骤（3）：补充培养基和灭活血浆，加入脱氢抗坏血酸，继续培养2～3天，获得γδt细胞。
21、本专利技术还提供了制备γδt细胞的方法，包括如下步骤：
22、步骤（a）：取血液分离出外周血单个核细胞以及血浆，对血浆进行灭活获得灭活血浆；
23、步骤（b）：取含抗tcrγδ抗体的包被液包被培养瓶，往培养瓶中加入含il-2、il-7和il-18的培养基，取所述外周血单个核细胞接入所述培养基，并加入唑来膦酸、所述灭活血浆混合，培养3～5天；
24、步骤（c）：将细胞接入新的含il-2、il-7和il-18的培养基，并加入所述灭活血浆，培养3～5天；
25、步骤（d）：补充培养基和所述灭活血浆，加入脱氢抗坏血酸，继续培养2～3天，获得γδt细胞。
26、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法：
27、所述外周血单个核细胞的细胞数为1×106/ml～2×106/ml；和/或
28、所述含il-2、il-7和il-18的培养基中所述il-2的浓度为180～220 iu/ml；和/或
29、所述含il-2、il-7和il-18的培养基中所述il-7的浓度为8～12 ng/ml；和/或
30、所述含il-2、il-7和il-18的培养基中所述il-18的浓度为18～22 ng/ml；和/或
31、所述包被液中所述抗tcrγδ抗体的浓度为3～5 μg/ml；和/或
32、所述唑来膦酸的浓度为1.8～2.2 μm；和/或
33、所述灭活血浆的含量为2%（v/v）、3%（v/v）、4%（v/v）或5%（v/v）；和/或
34、所述脱氢抗坏血酸的浓度为280～320 μm；和/或
35、所述培养的条件为36～38℃、3%～5% co2。
36、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法：
37、所述抗tcrγδ抗体为抗人源tcrγδ抗体；
38、所述il-2为人源il-2；
39、所述il-7为人源il-7；
40、所述il-18为人源il-18；
41、所述灭活血浆为灭活人源血浆。
42、本专利技术还提供了预防或治疗肿瘤或癌症的方法，所述癌症包括结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.培养γδT细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：
3.制备γδT细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，包括：
【技术特征摘要】
1.培养γδt细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：
...【专利技术属性】
技术研发人员：徐道俊，古松海，陆婷婷，蔡晓晴，杨佳妮，杜娅霖，
申请(专利权)人：赛德特生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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