【技术实现步骤摘要】
本专利技术专利涉及分子生物学，具体而言，涉及一种地枫皮叶片基因组dna提取方法。
技术介绍
1、地枫皮(illicium difengpi k.i.b.&k.i.m.ex b.n.chang)系五味子科(schisandraceae)八角属(illicium)多年生常绿灌木，为喀斯特特有植物，主要生长在石山山顶的裸岩及半裸岩山上，被历版《中国药典》收载的经典壮药，具祛风除湿，行气止痛等功效。地枫皮野生资源薀藏量很小，多以隔离的小种群形式存在。目前，该物种正处于濒危状态，《国家重点保护野生植物名录》(2021版)(https://www.forestry.gov.cn/main/3954/20210908/163949170374051.html)和《中国植物红皮书》将其列为国家二级重点保护植物。采用分子标记技术对地枫皮进行遗传变异、遗传结构和种群动态分析，可为地枫皮的保护和合理利用提供指导，但由于地枫皮生境的特殊性，使其叶片中富含多糖、蛋白质、莽草酸、维生素等次生代谢物，严重影响了地枫皮基因组dna提取的效果。
2、基因组dna的提取是分子生物学研究的基础，常用的基因组dna提取方法有：ctab法、sds法、试剂盒等。采用上述几种方法提取地枫皮dna时，由于次生代谢物与dna结合成粘稠的胶状物，致使dna提取和检测时分离困难、上样困难、电泳困难。凝胶电泳检测显示dna得率很低，电泳带明显变暗或者无法检测到可以分辨的条带(如图1～图3所示)。
3、为此，本专利技术旨在提供一种地枫皮叶片基因组dna提
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于解决
技术介绍
中提出的技术问题，提供一种地枫皮叶片基因组dna提取方法。
2、本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
3、一种地枫皮叶片基因组dna提取方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
4、s1、取0.3-1.0g成熟叶片，用液氮充分研磨成粉末后，装入-20℃预冷的离心管中；
5、s2、加入山梨醇洗涤缓冲液，填充至约3/4容量，充分混匀，于12000rpm常温离心5min，弃上清液；
6、s3、加入65℃预热的4％sds提取液5ml，充分混匀，置于65℃恒温水浴箱中0.5～1h，每隔5min上下颠倒混匀，水浴后常温冷却5min；
7、s4、加入5mol/l乙酸钠溶液2ml，摇匀，冰水浴10min，于12000rpm常温离心10min，取上清液转移至2ml离心管中；
8、s5、加入等体积的氯仿/异戊醇混合液进行抽提，充分混匀，于12000rpm常温离心10min，取上清液移至2ml离心管中；
9、s6、加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀，置于-20℃冰箱2h或者过夜沉淀，即dna沉淀；
10、s7、用枪头或者铂丝挑出dna沉淀至2ml离心管中；
11、s8、加入1ml的75％乙醇洗涤dna，于12000r/min低温离心2min，弃上清液，洗涤两次后将离心管开盖晾干；
12、s9、加入400μl te缓冲液溶解dna，并加入2μl rna酶于37℃消化30min；
13、s10、加入等体积的氯仿/异戊醇混合液进行抽提，颠倒混匀，于12000rpm常温离心10min，取上清液转移至2ml离心管中；
14、s11、加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻轻混匀，于12000r/min低温离心10min，弃上清液；
15、s12、加入1ml的75％乙醇洗涤dna，于12000r/min低温离心2min，弃上清液，洗涤两次后将离心管开盖晾干，加入200μl已灭菌的超纯水溶解dna沉淀，置于-20℃冰箱中保存。
16、进一步的，在s7步骤之后，若dna呈现果冻状，则还包括以下步骤：
17、a、加入600μl 1mol/l nacl溶解dna，于12000r/min常温离心10min，取上清转移至2ml离心管中；
18、b、加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀，置于-20℃冰箱2h或过夜沉淀；于12000rpm低温离心10min，弃上清液。
19、进一步的，所述山梨醇洗涤缓冲液的成分为：0.005mol/l edta、0.1mol/ltris-hcl、1％pvp40(w/v)、0.35mol/l山梨醇、1％β-巯基乙醇。
20、进一步的，所述4％sds提取液的成分为：0.05mol/l edta、0.1mol/ltris-hcl、0.5mol/lnacl，4％sds(w/v)、4％pvp40(w/v)、3％β-巯基乙醇。
21、进一步的，所述te缓冲液的成分为：1mol/l tris-hcl和0.5mol/l edta。
22、进一步的，步骤s7中，若无法挑出dna，则使用12000rpm低温离心10min以获得dna沉淀，转移至2ml离心管中。
23、进一步的，若步骤s2中的上清液高度浑浊或粘稠，则重复一次步骤s2。
24、本专利技术解决技术问题的难度及意义在于：
25、由于地枫皮生境的特殊性，使其叶片中富含多糖、蛋白质、莽草酸、维生素等次生代谢物，严重影响了地枫皮基因组dna提取的效果。目前，采用现有技术中常用的基因组dna提取方法提取地枫皮dna时，由于次生代谢物与dna结合成粘稠的胶状物，致使dna提取和检测时分离困难、上样困难、电泳困难；此外，凝胶电泳检测显示dna得率很低，电泳带明显变暗或者无法检测到可以分辨的条带。为此，本专利技术提供的一种地枫皮叶片基因组dna提取方法，对于得到地枫皮基因组dna的质量以及其能够满足后续实验要求方面具备重要的进步意义。
26、综上所述，与现有技术相比，本专利技术具备以下有益效果：
27、1、本专利技术的方法中，采用成熟叶片为提取材料，对提取材料的要求宽松，可以在植物生长的任何时候取材，并且获得的基因组dna能够满足后续实验要求；
28、2、本专利技术的方法中，在sds提取液裂解前，采用山梨醇洗涤缓冲液反复预处理液氮研磨的叶片组织样，且前后共处理2次，能够大量除去干扰dna分离的次生代谢产物；
29、3、本专利技术的方法对传统sds法进行了改良，在4％sds提取液加入4％pvp，再经抽提和离心，可分离到高质量的地枫皮基因组dna，能够满足分子生物学研究的要求，且经检测，采用本专利技术方法得到的地枫皮基因组dna质量高。
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1.一种地枫皮叶片基因组DNA提取方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种地枫皮叶片基因组DNA提取方法，其特征在于，在S7步骤之后，若DNA呈现果冻状，则还包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的一种地枫皮叶片基因组DNA提取方法，其特征在于，所述山梨醇洗涤缓冲液的成分为：0.005mol/L EDTA、0.1mol/L Tris-HCl、1％PVP40(w/v)、0.35mol/L山梨醇、1％β-巯基乙醇。
4.根据权利要求1所述的一种地枫皮叶片基因组DNA提取方法，其特征在于，所述4％SDS提取液的成分为：0.05mol/L EDTA、0.1mol/L Tris-HCl、0.5mol/LNaCl，4％SDS(w/v)、4％PVP40(w/v)、3％β-巯基乙醇。
5.根据权利要求1所述的一种地枫皮叶片基因组DNA提取方法，其特征在于，所述TE缓冲液的成分为：1mol/L Tris-HCl和0.5mol/L EDTA。
6.根据权利要求1所述的一种地枫皮叶片基因组DNA提取方法，其特
7.根据权利要求1所述的一种地枫皮叶片基因组DNA提取方法，其特征在于，若步骤S2中的上清液高度浑浊或粘稠，则重复一次步骤S2。
...【技术特征摘要】
1.一种地枫皮叶片基因组dna提取方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种地枫皮叶片基因组dna提取方法，其特征在于，在s7步骤之后，若dna呈现果冻状，则还包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的一种地枫皮叶片基因组dna提取方法，其特征在于，所述山梨醇洗涤缓冲液的成分为：0.005mol/l edta、0.1mol/l tris-hcl、1％pvp40(w/v)、0.35mol/l山梨醇、1％β-巯基乙醇。
4.根据权利要求1所述的一种地枫皮叶片基因组dna提取方法，其特征在于，所述4％sds提取液的成分为：0.05mol/l edta、0.1mo...
【专利技术属性】
技术研发人员：张秀姣，甘翔，黄夕洋，杨小丽，李虹，王雨坤，王满莲，唐辉，
申请(专利权)人：广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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