【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体地说，涉及一套用于鉴定野牛草性别的ssr分子标记组合及其应用。
技术介绍
1、野牛草(buchloe dactyloides)是禾本科画眉草亚科植物，原产北美干旱半干旱矮草原。20世纪40年代作为水土保持植物引入我国，表现出良好的适应性。野牛草多为雌雄异株，鲜有雌雄同株，单一种植雄性野牛草植株时，可不产生种子又能维持良好的绿化效果，是机场飞行区鸟防草坪建植的理想选择。根据野牛草雌、雄株和雌雄同株的转录组数据开发ssr分子标记，筛选雌雄株特异的ssr分子标记。研究野牛草性别的鉴定技术，以期在幼坪期能够进行准确鉴别雌雄株。
2、近年来，ssr指纹图谱被广泛用于栽培植物品种的鉴定和分类研究，在dna层面进行品种鉴定具有高效、准确的优点。分子标记是以核酸的多态性为基础的遗传标记，不受组织类别、发育时期、环境条件等干扰，具有数量多、多态性高等优点，是理想的遗传标记。分子标记已广泛应用于种质资源研究、杂种鉴定、遗传图谱构建、目的基因定位、遗传多样性研究等。其中，微卫星(microsatellite)，即简单重复序列(simple sequence repeat，ssr)，是由2-6个核甘酸串联重复片段构成的均匀分布于基因组中的简单重复序列；具有多态性高、稳定性好、多等位基因、共显性、数量丰富、基因组覆盖性好和操作简单等优点。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一套用于鉴定野牛草性别的ssr分子标记组合及其应用。
2、为了实现本专利技术目的，
3、用于扩增ssr分子标记pbssr-7、pbssr-8、pbssr-18和pbssr-22的引物分别如seqid no:1-2、seq id no:3-4、seq id no:5-6和seq id no:7-8所示。
4、第二方面，本专利技术提供用于扩增所述ssr分子标记组合的引物组，所述引物组由seq id no:1-2、seq id no:3-4、seq id no:5-6和seq id no:7-8所示的引物组成。
5、第三方面，本专利技术提供含有所述引物组的检测试剂或试剂盒。
6、第四方面，本专利技术提供所述ssr分子标记组合、所述引物组或所述检测试剂或试剂盒的以下任一应用：
7、1)用于鉴定野牛草性别；
8、2)构建野牛草ssr指纹图谱。
9、第五方面，本专利技术提供一种鉴定野牛草性别的方法，包括以下步骤：
10、(1)提取待测野牛草的基因组dna；
11、(2)以基因组dna为模板，分别利用seq id no:1-2、seq id no:3-4、seq id no:5-6和seq id no:7-8所示的四对引物进行pcr扩增；
12、(3)分析pcr扩增产物：
13、上述四对引物对应的扩增产物分别出现220bp、200bp、300bp和180bp大小的特征条带，则待测野牛草为雌性植株；
14、上述四对引物中的至少一对，其对应的扩增产物未出现上述特征条带，则待测野牛草为雄性植株。
15、优选地，所述pcr扩增的反应体系为：2×taq master mix 5μl、100μmol/l正向、反向引物各1μl、20ng/μl基因组dna 1μl和ddh2o 2μl。
16、优选地，所述pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸10分钟。
17、进一步地，步骤(1)使用ctab法提取待测野牛草的基因组dna，具体如下：
18、植物样品的幼嫩叶片约100mg加入700μl ctab溶液研磨后涡旋；65℃水浴30分钟；加入350μl氯仿-异戊醇(氯仿和异戊醇的体积比为24:1)与350μl饱和酚，于冰上静置10分钟；4℃，12000rpm离心10分钟；弃上清，加入等体积的70％酒精，4℃，12000rpm离心5分钟；弃上清，加入等体积的70％酒精，4℃，12000rpm离心5分钟；晾干，加入水稀释至dna浓度20ng/μl，-20℃条件存放。
19、进一步地，步骤(3)采用聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法分析扩增产物。
20、本专利技术提供一套快速鉴定野牛草性别的ssr分子标记组合以及鉴定野牛草性别的方法，包括以下步骤：a1，基因组dna的提取；a2，ssr分析；a3，性别鉴定。本专利技术通过野牛草雌、雄株转录组测序开发ssr标记，并筛选出4对能够筛选野牛草性别的分子标记，对95种确定性别的野牛草品种进行pcr扩增；使用聚丙烯酰胺凝胶电泳通过快速银染法分离扩增产物，根据条带辨别野牛草性别，在此基础上可以直观地对它们进行性别鉴定。结果验证4对分子标记引物结合能将这95份野牛草的性别进行区分，分别为pbssr-7、pbssr-8、pbssr-18和pbssr-22，可扩增出雌性野牛草特异性条带，大小分别为220bp、200bp、300bp和180bp。4对引物相组合在特异条带大小处全部有条带的为雌性植株，其余为雄性植株。4对引物组合对野牛草性别区分的准确率高达88.4％。本方法操作简便，费用低，准确度高且通用性好，能够选用4对引物对野牛草性别进行鉴定，丰富了野牛草ssr分子标记引物，大大提高性别鉴定效率。
21、本专利技术在对野牛草雌雄株转录组测序开发ssr标记的基础上，筛选出4对与性别相关的引物，对95种确定性别的野牛草进行分子标记鉴定，同时开发雌性特异性条带，为野牛草的性别鉴定提供了有力工具。
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1.用于鉴定野牛草性别的SSR分子标记组合，其特征在于，所述组合包括SSR分子标记PbSSR-7、PbSSR-8、PbSSR-18和PbSSR-22；
2.用于扩增权利要求1所述SSR分子标记组合的引物组，其特征在于，所述引物组由SEQID NO:1-2、SEQ ID NO:3-4、SEQ ID NO:5-6和SEQ ID NO:7-8所示的引物组成。
3.含有权利要求2所述引物组的检测试剂或试剂盒。
4.权利要求1所述SSR分子标记组合、权利要求2所述引物组或权利要求3所述检测试剂或试剂盒的以下任一应用：
5.鉴定野牛草性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：2×TaqMaster Mix 5μL、100μmol/L正向、反向引物各1μL、20ng/μL基因组DNA 1μL和ddH2O2μL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，3
8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)使用CTAB法提取待测野牛草的基因组DNA，具体如下：
9.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)采用聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法分析扩增产物。
...【技术特征摘要】
1.用于鉴定野牛草性别的ssr分子标记组合，其特征在于，所述组合包括ssr分子标记pbssr-7、pbssr-8、pbssr-18和pbssr-22；
2.用于扩增权利要求1所述ssr分子标记组合的引物组，其特征在于，所述引物组由seqid no:1-2、seq id no:3-4、seq id no:5-6和seq id no:7-8所示的引物组成。
3.含有权利要求2所述引物组的检测试剂或试剂盒。
4.权利要求1所述ssr分子标记组合、权利要求2所述引物组或权利要求3所述检测试剂或试剂盒的以下任一应用：
5.鉴定野牛草性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：滕珂，郭一荻，范希峰，岳跃森，滕文军，常智慧，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：
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