【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体地说涉及一种酮还原酶突变体及其应用。
技术介绍
1、手性醇作为重要中间体，广泛用于手性药物和其他手性精细化学品的合成。许多手性药物都含有一个或多个手性中心，不同手性药物的药理活力、代谢过程、代谢速率以及毒性有显著差异。手性醇的生产有多种，比如通过动力学拆分理论收率较低，成本较高。利用手性恶唑硼烷硼氢化、手性过渡金属也可不对称催化氢化合成手性醇，然而反应条件比较剧烈，如高温高压等，同时涉及到过渡金属等有毒试剂残留问题。
2、酮还原酶将酮立体选择性地还原为醇，酮还原酶用作催化剂来替代传统化学催化剂，具有反应温和，环境污染少等优点，在制药领域获得了极大的关注。
3、利用酮还原酶催化合成手性醇是极为有潜力的催化方式，但是该方法也存在一些问题，包括酮还原酶本身在生产反应条件下缺乏稳定性，产物抑制，酶的催化活力低，对底物催化还原的选择性低，许多感兴趣的底物的水溶性低等。因此，对很多具体的酮底物来说，在将其利用酮还原酶催化还原为手性醇的过程中，现有的酮还原酶大多情况下催化效果不佳，因此，需要寻找合适的酮还原酶，或者通过理性设计提高已知酮还原酶的活性和特异性，促进其利用酮还原酶催化还原成为特定构型的醇。
4、例如，维贝格龙(vibegron)是一种β-3肾上腺素能激动剂，用于治疗膀胱过度活动症(oab)患者的急迫性尿失禁、尿急和尿频症状。对于维贝格龙中间体式i-4化合物(其结构见下面的反应式1)来说，其可以通过酮还原酶催化还原式i-3化合物得到，但是对式i-3化合物这种非天然底物底物来
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6、因此，对式i-3化合物的还原来说，需要一种用量少、使用简单、活性好且选择性好的酮还原酶。
技术实现思路
1、本专利技术的一方面提供了一种能催化酮类化合物制备手性醇化合物的酮还原酶突变体，其活性高、选择性好，可直接使用含该酮还原酶突变体的菌体湿细胞进行催化。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用以下技术方案：
2、一种酮还原酶突变体，该酮还原酶突变体的氨基酸序列是由seq id no.1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述突变至少包括如下突变位点中的一个：第157位由y突变为f或m，第161位由k突变为m或a，第187位由p突变为a或w，第192位由t突变为l或a，或者所述酮还原酶突变体具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且其氨基酸序列与发生突变的氨基酸序列具有85％以上同源性。
3、在另一优选例中，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3、seq idno.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7或seq id no.8所示；或者所述酮还原酶突变体的氨基酸序列与如seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq idno.7或seq id no.8所示的氨基酸序列具有85％以上同源性。
4、在另一优选例中，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如seq id no.4或seq idno.5所示。在另一更优选例中，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如seq id no.5所示。
5、本专利技术另一方面提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述酮还原酶突变体。
6、在另一优选例中，所述多核苷酸的序列如seq id no.9、seq id no.10、seq idno.11、seq id no.12、seq id no.13或seq id no.14所示，或者所述多核苷酸的核苷酸序列与如seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11、seq id no.12、seq id no.13或seq idno.14所示的核苷酸序列具有85％以上同源性。
7、在另一优选例中，所述多核苷酸的核苷酸序列如seq id no.10或seq id no.11所示。
8、本专利技术另一方面提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体中含有上述多核苷酸。
9、本专利技术另一方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞其包含上述重组表达载体。
10、本专利技术另一方面提供了上述酮还原酶突变体在催化酮类化合物制备手性醇类化合物中的应用，
11、所述酮类化合物的结构式为其中，r1选自苯基，r2选自c1～c8烷基，其中所述苯基和所述c1～c8烷基任选地进一步被一个或多个选自羟基、氨基、卤素、硝基、氰基、羧基、c1～c8烷基、c1～c8烷氧基、c5～c10环烷基、c2～c6酯基、c2～c8烯基、c2～c8炔基、c4～c11杂环基、c5～c10芳基、c5～c10杂芳基的取代基所取代，
12、所述醇类化合物为其中r1和r2的定义如上。
13、在另一优选例中，所述酮类化合物为式i化合物，所述醇类化合物为式ii化合物，
14、本专利技术再一方面提供了一种式ii化合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
15、在酮还原酶存在下，使式i所示化合物还原得到式ii所示化合物，反应式如下：
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17、其中，所述酮还原酶的氨基酸序列如seq id no.5所示。
18、在另一优选例中，所述酮还原酶为游离形式、固定化形式或菌体形式。
19、在另一优选例中，所述酮还原酶为菌体形式。在另一优选例中，菌体形式的酮还原酶是通过离心得到的。
20、在另一优选例中，反应体系中，离心得到的菌体形式的酮还原酶与底物的重量比为5％～40％，更佳地10％～30％。
21、在另一优选例中，反应体系中，离心得到的菌体形式的酮还原酶与反应溶剂的重量体积比为5g/l～50g/l，更佳地10g/l～30g/l。
22、在另一优选例中，离心得到菌体形式的酮还原酶的过程包括步骤：在10000rpm～15000rpm，离心8～15min，弃上清，得到细胞沉淀，即为菌体形式的酮还原酶。
23、在另一优选例中，式ii化合物的制备方法中，反应体系中还存在辅酶。
24、在另一优选例中，所述辅酶选自nadp+、nadp盐或nadph，更优选nadp盐。
25、在另本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列是由SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述突变至少包括如下突变位点中的一个：
2.根据权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ IDNO.8所示，或者
3.根据权利要求2所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示，更佳地，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQID NO.5所示。
4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1至3任一项所述的酮还原酶突变体。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示，或者
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7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求6所述的重组表达载体。
8.权利要求1至3任一项所述的酮还原酶突变体在催化酮类化合物制备手性醇类化合物中的应用，
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述酮类化合物为式I化合物，
10.一种式II化合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列是由seq idno.1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述突变至少包括如下突变位点中的一个：
2.根据权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7或seq idno.8所示，或者
3.根据权利要求2所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如seq id no.4或seq id no.5所示，更佳地，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如seqid no.5所示。
4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1至3任一项所...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭万成，柳学伟，李娟，刘鸿中，徐蕾萍，信臣博，王宁波，信铭雁，
申请(专利权)人：扬州联澳生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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