【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物标志物纯化分析，具体涉及一种生物样本中外泌体快速分离和分析的方法及应用。
技术介绍
1、外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的膜性囊泡，直径为30-150nm。几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体，被分泌出的外泌体会进入血液、尿液等各种体液中，通过循环系统到达其它细胞与组织，可作为细胞间通讯的重要介质。众多研究表明外泌体是多种疾病的可靠预警生物标志物，可通过液体活检技术用于疾病的分析。因此，外泌体的分离纯化和分析技术成为未来疾病筛查诊断分析的一个重要发展方向。
2、目前，常见的外泌体分离方法包括超速离心法、聚合物沉淀法、免疫吸附分离法等。然而，复杂的样品处理，昂贵的分析设备和大量的样品需求表明，这些方法存在费时费力、回收率低、成本高以及步骤复杂等缺陷。新兴的方法如表面等离子共振平台、表面增强拉曼光谱、电化学方法、集成微流体平台等可以实现高度富集，但后续的捕获释放方法通常使用高浓度盐或超酸性缓冲液洗脱，或者基于抗体-抗原键的破坏进行释放，极易损坏外泌体形态及结构。另外，在后续的分析中，传统的液质联用法因其复杂的样品预处理方法，且通常需要毫升级别的样品量，对微量样品的小分子的快速高效的分析带来了极大困难。因此，本专利技术针对现有分离纯化方法易损害外泌体、纯度低以及传统液质联用方法样品预处理复杂、需样品量大的问题，构建了一种外泌体快速分离和分析的策略。
技术实现思路
1、针对传统方法分离纯化和分析外泌体存在的问题，本专利技术提供了一
2、为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术提供了一种用于外泌体富集的探针，所述探针包括核酸适配体aptamer1，互补链strand2和strand3，其中，所述aptamer1、strand2和strand3互补配对并连接在超顺磁性颗粒表面。
4、在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸适配体aptamer1的核苷酸序列如seq idno.1所示。
5、在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸适配体aptamer1的5’端连接羧基，3’端连接淬灭基团。
6、在本专利技术的一种实施方式中，所述strand2的核苷酸序列如seq id no.2所示。
7、在本专利技术的一种实施方式中，所述strand2的5’端连接荧光基团。
8、在本专利技术的一种实施方式中，所述strand3的核苷酸序列如seq id no.3所示。
9、在本专利技术的一种实施方式中，所述超顺磁性颗粒包括氨基磁珠(mb-nh2)。
10、在本专利技术的一种实施方式中，所述淬灭基团选自tamra、eclipse、dabcyl、bhq1或bhq2。
11、在本专利技术的一种实施方式中，所述荧光基团选自fam、fitc、cy5、tet、vic、joe或hex。
12、所述aptamer1的序列如下所示：
13、5’-cooh-aaattttttttttttaaacaccccacctcgctcccgtgacactaatg-bhq1-3’。
14、所述strand2与aptamer1的3’端的部分互补，序列如下所示：
15、5’-6fam-cattagtgtca-3’。
16、所述strand3与aptamer1的5’端的部分互补，序列如下所示；
17、5’-aaaaaaaaaaaa-3’。
18、本专利技术提供了一种制备所述探针的方法，具体步骤如下：
19、(1)将核酸适配体aptamer1、strand2、strand3按照等物质的量混合，然后加入至盐溶液混匀后经热处理，获得aptamer1/strand2/strand3溶液；
20、(2)稀释步骤(1)合成的aptamer1/strand2/strand3溶液，随后加入nhs溶液和edc溶液，混合振荡，获得活化后的aptamer1/strand2/strand3溶液；
21、(3)将超顺磁性颗粒与步骤(2)活化的后aptamer1/strand2/strand3溶液混合，孵育，然后磁分离弃上清，用超纯水洗涤沉淀并重新分散在超纯水中，制备获得探针；
22、在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中，所述盐溶液包括nacl100mm，mgcl25mm，tris-hcl10mm。
23、在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中，所述热处理的程序为95℃10min，30℃30min，4℃20min。
24、在本专利技术的一种实施方式中，所述超顺磁性颗粒包括氨基磁珠(mb-nh2)。
25、本专利技术提供了一种快速富集外泌体的方法，所述方法为利用上述探针富集外泌体，外泌体特异性结合至探针表面。
26、在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为将上述探针与含有外泌体的样品溶液混合孵育。
27、在本专利技术的一种实施方式中，所述外泌体为体液中的外泌体；优选的，所述外泌体为尿液外泌体、血液外泌体或脑脊液外泌体中的一种。
28、在本专利技术的一种实施方式中，所述混合孵育为在室温下孵育60min以上。
29、本专利技术提供了一种分离纯化外泌体的方法，所述方法为利用上述探针富集外泌体，获得表面结合有外泌体的探针，磁分离弃去上清，洗涤并重悬，加入内切酶，混合孵育，从探针表面释放外泌体，磁分离，收集上清，获得外泌体。
30、在本专利技术的一种实施方式中，加入内切酶后于35～38℃孵育20～40min。
31、在本专利技术的一种实施方式中，所述内切酶为具有切割dna双链功能活性的酶。
32、在本专利技术的一种实施方式中，所述内切酶包括dsdnaseⅰ或nt.alwi。
33、本专利技术还提供了所述探针或所述制备探针的方法在制备外泌体富集或外泌体分离纯化产品中的应用。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于外泌体富集的探针，其特征在于，所述探针包括核酸适配体Aptamer 1，互补链Strand2和Strand 3，其中，所述Aptamer 1、Strand2和Strand 3互补配对并连接在超顺磁性颗粒表面；
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述核酸适配体Aptamer 1的5’端连接羧基，3’端连接淬灭基团；所述Strand2的5’端连接荧光基团。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述淬灭基团选自TAMRA、ECLIPSE、DABCYL、BHQ1或BHQ2；所述荧光基团选自FAM、FITC、CY5、TET、VIC、JOE或HEX。
4.一种制备权利要求1～3任一所述探针的方法，其特征在于，具体步骤如下：
5.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，步骤(1)中，所述热处理的程序为95℃10min，30℃30min，4℃20min。
6.一种快速富集外泌体的方法，其特征在于，所述方法为利用权利要求1～3任一所述探针富集外泌体，外泌体特异性结合至探针表面。
7.根据权利要求6所述的
8.一种分离纯化外泌体的方法，其特征在于，所述方法为利用权利要求1～3任一所述探针富集外泌体，获得表面结合有外泌体的探针，磁分离弃去上清，洗涤并重悬，加入内切酶，混合孵育，从探针表面释放外泌体，磁分离，收集上清，获得外泌体；优选的，所述内切酶为具有切割DNA双链功能活性的酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，加入内切酶后于35～38℃孵育20～40min。
10.权利要求1～3任一所述探针，或者权利要求4或5所述方法在制备外泌体富集或外泌体分离纯化的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于外泌体富集的探针，其特征在于，所述探针包括核酸适配体aptamer 1，互补链strand2和strand 3，其中，所述aptamer 1、strand2和strand 3互补配对并连接在超顺磁性颗粒表面；
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述核酸适配体aptamer 1的5’端连接羧基，3’端连接淬灭基团；所述strand2的5’端连接荧光基团。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述淬灭基团选自tamra、eclipse、dabcyl、bhq1或bhq2；所述荧光基团选自fam、fitc、cy5、tet、vic、joe或hex。
4.一种制备权利要求1～3任一所述探针的方法，其特征在于，具体步骤如下：
5.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，步骤(1)中，所述热处理的程序为95℃10min，30℃30min，4℃20min。
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