【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重组人源超氧化物歧化酶的制备领域，特别涉及一种重组人源超氧化物歧化酶的制备方法及应用。
技术介绍
1、人源超氧化物歧化酶(human superoxide dismutase，sod)是一种重要的抗氧化酶，它在人体中发挥着关键的保护作用，超氧化物歧化酶主要负责将有害的超氧自由基(superoxide radicals)转化为较为稳定的分子，从而减少氧化应激(oxidative stress)对细胞和组织的损伤。超氧自由基是一种高度活跃的氧自由基，它们可以与生物体内的脂质、蛋白质和核酸等分子发生氧化反应，从而导致细胞损伤和机体老化，甚至参与疾病的发生和发展，而超氧化物歧化酶通过将超氧自由基催化转化为氧和过氧化氢，有效地抑制了超氧自由基的活性，起到了抗氧化保护的作用。
2、目前市面上已有较多制备重组人源超氧化物歧化酶的方法，具体步骤为：从人体组织中克隆出编码超氧化歧化酶的基因序列，将该基因序列插入到表达载体中并转化至宿主细胞中进行表达，常见的表达宿主有大肠杆菌、酵酒酵母等，宿主细胞经过培养和诱导表达出重组的人源超氧化物歧化酶，随后对表达的人源超氧化歧化酶进行纯化处理后去除杂质以提高纯度，然而目前市面上选择的表达人源超氧化物歧化酶的表达系统都有其自身的局限性：例如，在大肠杆菌表达系统中形成的包涵体和内毒素增加了生产成本，因此限制了其在大规模异源蛋白表达方面的应用，在酵酒酵母表达系统中由于缺乏强大且严格调节的启动子，其分泌效率相对较低。
技术实现思路
1、本专利技
2、为实现以上目的，本技术方案提供了一种重组人源超氧化物歧化酶的制备方法，包括以下步骤：
3、s1:自人类huh7细胞中扩增得到hsod1编码序列基因，利用bamhi和ap酶切
4、pht43-his载体，并将hsod1编码序列基因同pht43-his载体利用分子克隆技术连接得到重组载体；
5、s2：培养得到枯草芽孢杆菌感受态细胞作为表达菌株；
6、s3：将重组载体同枯草芽孢杆菌感受态细胞混合并置于加入乳糖的培养基中在37℃下培养24小时，其中培养基中含有肉葡萄糖胨、酵母提取物、k2hpo4和葡萄糖；
7、s4：取出培养基离心后得到细胞上清液，纯化上清液得到重组人源超氧化物歧化酶。
8、相较于现有技术，本技术方案具有以下特点和有益效果：
9、本方案选择枯草芽孢杆菌作为表达菌株，由于枯草芽孢杆菌具有较高的表达能力和稳定性且枯草芽孢杆菌是安全性极高的天然来源微生物，故可以克服传统的大肠杆菌和酵母表达系统存在的缺陷。不仅如此，本方案筛选耐高糖的谷草芽孢杆菌作为表达菌株并选择乳糖作为表达的诱导剂的方式成功表达重组人源超氧化物歧化酶，实现了低成本的产业化规模生产。
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1.一种重组人源超氧化物歧化酶制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的重组人源超氧化物歧化酶制备方法，其特征在于，取SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.2的hSOD1序列引物对以人类Huh7细胞的cDNA为模板进行PCR扩增得到hSOD1编码序列基因。
3.根据权利要求1所述的重组人源超氧化物歧化酶制备方法，其特征在于，PCR的扩增条件为：94℃ 2min；35个循环，每个循环包括94℃ 15s，55℃30s，和68℃ 25s。
4.根据权利要求1所述的重组人源超氧化物歧化酶制备方法，其特征在于，将hSOD1编码序列基因同pHT43-His载体加入到Hi-Fusion Cloning Mix V2混合体系中得到连接产物，将连接产物转化到大肝肠菌DH5α感受态细胞中通过菌落PCR和测序对阳性转化子进行筛选出成功重组hSOD1编码序列基因的重组载体。
5.根据权利要求1所述的重组人源超氧化物歧化酶制备方法，其特征在于，取普通的枯草芽孢杆菌以营养琼脂为培养基先进行试管斜面培养筛选出典型的枯草芽孢杆菌的单菌落；将典型的枯
6.根据权利要求5所述的重组人源超氧化物歧化酶制备方法，其特征在于，将标准菌株的枯草芽孢杆菌在5mL的LB培养基中在28℃下180rpm的摇床培养过夜，随后转移至10mL的SPI培养基中在37℃下180rpm的摇床培养一段时间后，在37℃下100rpm的摇床培养2天后加入EGTA并摇动培养24小时得到枯草芽孢杆菌感受态细胞作为表达菌株。
7.根据权利要求1所述的重组人源超氧化物歧化酶制备方法，其特征在于，培养基中含有30g/L的肉葡萄糖胨、15g/L的酵母提取物、2g/L的K2HPO4和25g/L的葡萄糖。
8.根据权利要求1所述的重组人源超氧化物歧化酶制备方法，其特征在于，乳糖的浓度为20g/L。
9.根据权利要求1所述的重组人源超氧化物歧化酶制备方法，其特征在于，使用HiTrapHeparin HP肝素亲和柱纯化细胞上清液。
10.根据权利要求1所述的重组人源超氧化物歧化酶制备方法，其特征在于，应用于制备重组人源超氧化物歧化酶。
...【技术特征摘要】
1.一种重组人源超氧化物歧化酶制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的重组人源超氧化物歧化酶制备方法，其特征在于，取seq idno.1-seq id no.2的hsod1序列引物对以人类huh7细胞的cdna为模板进行pcr扩增得到hsod1编码序列基因。
3.根据权利要求1所述的重组人源超氧化物歧化酶制备方法，其特征在于，pcr的扩增条件为：94℃ 2min；35个循环，每个循环包括94℃ 15s，55℃30s，和68℃ 25s。
4.根据权利要求1所述的重组人源超氧化物歧化酶制备方法，其特征在于，将hsod1编码序列基因同pht43-his载体加入到hi-fusion cloning mix v2混合体系中得到连接产物，将连接产物转化到大肝肠菌dh5α感受态细胞中通过菌落pcr和测序对阳性转化子进行筛选出成功重组hsod1编码序列基因的重组载体。
5.根据权利要求1所述的重组人源超氧化物歧化酶制备方法，其特征在于，取普通的枯草芽孢杆菌以营养琼脂为培养基先进行试管斜面培养筛选出典型的枯草芽孢杆菌的单菌落；将典型的枯草芽孢杆菌转入营养琼脂试管斜面进行培养：在营养琼脂试管斜面中增加高含量的乳糖、葡萄糖以及肉葡萄糖胨得到...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈依唐，李贝贝，包康娜，张锦玉，
申请(专利权)人：杭州三言生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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