【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞免疫领域，更具体涉及一种靶向cd19和/或cd20的car-nk细胞及其制备与应用。
技术介绍
1、cd19和cd20是b细胞表面标志物，高表达于成熟的正常b细胞以及恶性b细胞表面，是治疗b细胞源性恶性血液肿瘤疾病的热门靶点，以上述标志物为靶点的产品如单克隆抗体、双抗、adc和car-t细胞的研发和临床试验不断涌现。
2、car-t细胞疗法目前已在血液系统恶性肿瘤的治疗中取得了巨大的成功，但car-t细胞引发的细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,crs)以及免疫效应细胞相关神经毒性综合征(icans)是car-t细胞疗法常见且严重的不良反应。与此同时car-t细胞的生产和应用也存在一定的局限性，需要耗费大量的人力、物力和时间，因此car-t细胞治疗的价格也居高不下。此外，部分患者可能由于免疫抑制或放化疗影响，导致自体t细胞耗竭、衰老并发生功能缺陷，最终将影响car-t细胞质量及功能，从而严重影响临床疗效。
3、对此，本领域需要开发相比car-t细胞更具优势的car-nk细胞疗法。
4、此外，目前临床上大多使用逆转录病毒或慢病毒等病毒载体来稳定引入car。例如，通过病毒载体转导或质粒载体转染，将car基因转入t细胞中从而获得car-t细胞，当大量扩增的car-t细胞回输到患者体内后，car能特异性地识别肿瘤抗原，活化后的t细胞可以杀伤肿瘤细胞，从而达到精准治疗肿瘤目的。但传统car基因递送的方法是用病毒载体递送以随机整合的形式插入到基因组中，
5、因此，本领域迫切需要开发靶向cd19和/或cd20的car-nk细胞疗法，以及通过非病毒载体依赖的转染方式制备car-nk细胞的方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的就是提供一种靶向cd19和/或cd20的car-nk细胞及其制备与应用。
2、本专利技术的另一目的在于提供一种cd19 car-nk细胞联合利妥昔单抗(rituximab)的体内外协同抗肿瘤应用。
3、在本专利技术的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体(car)-nk细胞，所述car-nk细胞含有以下元件：
4、(a)第一car，所述第一car的胞外结合域含有靶向第一靶蛋白cd19的第一结合元件；
5、(b)任选地第二car，所述第二car的胞外结合域含有靶向第二靶蛋白cd20的第二结合元件。
6、在另一优选例中，所述car-nk细胞含有第一car。
7、在另一优选例中，所述car-nk细胞含有第一car和第二car。
8、在另一优选例中，所述第一car或第二car的结构如下式i所示：
9、l-eb-h-tm-c-cd3ζ (i)
10、式中，
11、各“-”独立地为连接肽或肽键；
12、l为无或信号肽序列；
13、eb为胞外结合域；
14、h为铰链区；
15、tm为跨膜区；
16、c为共刺激信号结构域；
17、cd3ζ为源于cd3ζ的胞浆信号传导序列。
18、在另一优选例中，所述l是本领域常用的免疫细胞表面分子的信号肽，优选为选自下组蛋白的信号肽：csf2rb、cd8、gm-csf、cd4、cd28、cd137、nkg2d，或其突变/修饰体，或其组合。
19、在另一优选例中，所述l为csf2rb信号肽，其具有如seq id no:4所示的氨基酸序列。
20、在另一优选例中，所述eb为靶向所述靶蛋白的抗体的抗原结合结构域scfv，所述的scfv的结构如下式a或式b所示：
21、vh-vl(a)
22、vl-vh(b)
23、式中，vh为抗体重链可变区；
24、vl为抗体轻链可变区；
25、“-”为连接肽或肽键。
26、在另一优选例中，当所述靶蛋白为cd19时，所述vh具有如seq id no:8所示的氨基酸序列，所述vl具有如seq id no:5所示的氨基酸序列；
27、或者，所述vh与seq id no:8所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性，所述vl与seq id no:5所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。
28、在另一优选例中，当所述靶蛋白为cd19时，所述vh具有如seq id no:8所示的氨基酸序列，所述vl具有如seq id no:5所示的氨基酸序列。
29、在另一优选例中，当所述靶蛋白为cd20时，所述vh具有如seq id no:10所示的氨基酸序列，所述vl具有如seq id no:9所示的氨基酸序列；
30、或者，所述vh与seq id no:10所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性，所述vl与seq id no:9所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。
31、在另一优选例中，当所述靶蛋白为cd20时，所述vh具有如seq id no:10所示的氨基酸序列，所述vl具有如seq id no:9所示的氨基酸序列。
32、在另一优选例中，所述连接肽具有如seq id no:6或7所示的氨基酸序列；优选地，具有如seq id no:7所示的氨基酸序列。
33、在另一优选例中，所述h是本领域常用的免疫细胞表面分子的铰链区，优选为为选自下组蛋白的铰链区：cd8(包括cd8α、cd8β)、cd28、cd137、igg，或其组合。
34、在另一优选例中，所述h为cd8α铰链区，具有如seq id no:11所示的氨基酸序列。
35、在另一优选例中，所述tm是本领域常用的免疫细胞表面分子的跨膜区，优选为选自下组蛋白的跨膜区：cd28、cd3 epsilon、cd45、cd4、cd5、cd8(包括cd8α、cd8β)、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、cd278、cd152、cd279、cd233，或其突变/修饰体，或其组合。
36、在另一优选例中，所述tm为cd8α跨膜区，具有如seq id no:12所示的氨基酸序列。
37、在另一优选例中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种嵌合抗原受体(CAR)-NK细胞，其特征在于，所述CAR-NK细胞含有以下元件：
2.如权利要求1所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述第一CAR或第二CAR的结构如下式I所示：
3.如权利要求1所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述第一CAR具有如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，和/或所述第二CAR具有如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-3中任一项所述的CAR-NK细胞中的元件(a)和/或(b)。
5.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求4所述的核酸分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有如权利要求5所述的载体，或其染色体中整合有外源的如权利要求4所述的核酸分子。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：
8.一种协同药物组合物，其特征在于，所述协同药物组合物含有：
9.一种权利要求1-3中任一项所述的CAR-NK细胞、如权利要求4所述的核酸分子、如权利要求
10.一种制备如权利要求1-3中任一项所述的CAR-NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将如权利要求4所述的核酸分子或如权利要求5所述的载体导入免疫细胞内，从而获得所述的CAR-免疫细胞。
...【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体(car)-nk细胞，其特征在于，所述car-nk细胞含有以下元件：
2.如权利要求1所述的car-nk细胞，其特征在于，所述第一car或第二car的结构如下式i所示：
3.如权利要求1所述的car-nk细胞，其特征在于，所述第一car具有如seq id no:15所示的核苷酸序列，和/或所述第二car具有如seq id no:16所示的核苷酸序列。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-3中任一项所述的car-nk细胞中的元件(a)和/或(b)。
5.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求4所述的核酸分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有如权利要求5所...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵星，何志旭，张彩丽，杨娜，林小金，范玉婷，张晶，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：
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