【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程技术与应用领域，具体地涉及一种生产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建方法。
技术介绍
1、3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid，3-hp)是一种高附加值化学品，与乳酸(2-羟基丙酸)互为同分异构体；此外，3-羟基丙酸分子两端的羟基和羧基赋予了3-羟基丙酸活泼的化学性质，这意味着它可以通过不同的化学反应转化为其他化学物质，如丙烯酸、1,3-丙二醇、聚(3-羟基丙酸酯)等，在医药工业、农业和新材料等领域拥有广泛的应用，不仅可以用于制作药品包装材料，而且还可用于生产可降解塑料作为普通塑料的替代品[1]。基于3-羟基丙酸的市场价值和应用前景，2004年和2010年，美国能源部两次将3-羟基丙酸列为12种最有前途和优先开发的化合物之一[2]。3-羟基丙酸的合成方式分为化学合成法和生物合成法两种。近年来，随着化石燃料的枯竭，使用更可持续的微生物发酵方法代替化学合成法来生产3-羟基丙酸吸引了研究者的注意。利用代谢工程途径合成3-羟基丙酸的最广泛研究途径有甘油途径、β-丙氨酸途径和丙二酰辅酶a途径。而在丙二酰辅酶a途径中，由乙酰辅酶a到3-羟基丙酸的标准吉布斯自由能变为–14.5kj/mol，热力学上较为有利[3]。该途径中涉及的代谢物多为胞内常见代谢物，因此，丙二酰辅酶a途径可利用多种底物来生产3-羟基丙酸。
2、目前以开发出多种碳源通过各种代谢途径合成3-羟基丙酸，其潜在原料有甘油、葡萄糖、木糖、脂肪酸、1,3-丙二醇和乙酸等。乙酸作为一种广泛存在的一元酸，可以从木质纤维素和c1气
3、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)是重要的工业微生物，具有遗传背景清晰、无致病性、不产孢子、食品安全性良好等优点，并且是gras认证(generallyrecognized as safe)的菌株，被认为是一种极有前途的3-羟基丙酸生产菌株。谷氨酸棒杆菌可以利用乙酸作为唯一碳源生长，并且其胞内乙酸的运输、利用以及调控等机制也有了透彻的研究。因此，在谷氨酸棒杆菌中以乙酸为单一底物来生产3-羟基丙酸具有巨大的应用前景。目前以乙酸为底物来生产化学品的研究大多是在大肠杆菌中进行的。noh[5]等人改造大肠杆菌利用乙酸生产了3.57g/l衣康酸；xu[6]等人在重组大肠杆菌中以乙酸为底物利用两阶段发酵生产了7.85g/l甲羟戊酸；lai[7]等人以乙酸和co2为底物，在大肠杆菌中利用全细胞催化生产了15.8g/l的3-羟基丙酸。这些研究都展现了以乙酸为底物生产各种化学品的可行性，但是这些研究都是在大肠杆菌中进行的。谷氨酸棒杆菌相较于大肠杆菌拥有较好的耐酸性，因此开发出能利用乙酸来高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株具有重要的研究意义。chang[8]等人在谷氨酸棒杆菌中以乙酸为单一底物同时添加浅蓝菌素在摇瓶中生产了4.26g/l 3-羟基丙酸，得率为0.50g/g乙酸；在5l发酵罐中可以生产17.1g/l 3-羟基丙酸。继续进行一系列代谢工程改造并对发酵条件进行优化后在5l发酵罐中获得了30.5g/l的3-羟基丙酸，得率为0.17g/g乙酸(参照已授权专利(专利号：cn202210673552.3，高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建方法与应用))。但是最终工程菌株的摇瓶产量和得率依然不理想，因此亟待开发能利用乙酸并能获得较高3-羟基丙酸得率的谷氨酸棒杆菌菌株。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供生产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株。
2、本专利技术的第二个目的是提供生产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法。
3、本专利技术的第三个目的是提供上述生产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株在生产3-羟基丙酸中的应用。
4、本专利技术的技术方案概述如下：
5、生产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，包括如下步骤：
6、(1)在谷氨酸棒杆菌重组菌株cy1中引入大肠杆菌来源的maeb基因；用psod*启动子替换异柠檬酸裂解酶acea基因的启动子；用ptuf启动子替换苹果酸合酶aceb基因的启动子；敲除编码rnase e/g的rneg基因；使用生长依赖启动子gpp1替换异柠檬酸脱氢酶icd基因的启动子；再在染色体上整合两个拷贝的mcr基因，得到菌株cy8；
7、(2)将pec-sod-n-hp-c*质粒导入步骤(1)获得的菌株cy8中，得到生产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株，简称菌株cy9。
8、所述maeb基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；
9、所述psod*启动子的核苷酸序列如seq id no.2所示；
10、所述ptuf启动子的核苷酸序列如seq id no.3所示；
11、所述rneg基因的核苷酸序列如seq id no.6所示；
12、所述生长依赖启动子gpp1的核苷酸序列如seq id no.7所示；
13、所述mcr基因的核苷酸序列如seq id no.9所示；
14、上述方法构建的生产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株。
15、上述菌株在生产3-羟基丙酸中的应用。
16、本专利技术的优点：本专利技术所构建的生产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株安全无害，在有氧条件下以乙酸为底物通过简单的发酵工艺生产3-羟基丙酸，60h时生产了5.41g/l的3-羟基丙酸，得率为0.58g/g乙酸，这为后续工业化生产3-羟基丙酸奠定了基础。
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1.生产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述：
3.权利要求1或2的方法构建的生产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株。
4.权利要求3的菌株在生产3-羟基丙酸中的应用。
【技术特征摘要】
1.生产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述：
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