【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种dna聚合酶及其用途。
技术介绍
1、phi29聚合酶作为枯草芽孢杆菌噬菌体phi29的dna聚合酶，具有很强的持续合成能力、链置换活性和高保真度。通过基因克隆与蛋白表达纯化技术，可以获得重组的phi29dna聚合酶。重组的phi29聚合酶可进行等温扩增、随机引物扩增和滚环复制，目前在单细胞、病原微生物以及全基因组的扩增，核酸检测，单细胞测序模板制备和dna测序等方向有着广泛应用。phi29聚合酶全长572个氨基酸，包括核酸外切酶、手掌、tpr1、手指、tpr2和拇指六种结构域，其中n端第5-190位氨基酸对应核酸外切酶结构域，与其3’-5’核酸外切酶活性和链置换能力有关；c端第531-575位氨基酸对应的拇指结构域能够与蛋白或dna结合从而起始dna扩增，与其dna聚合活性有关。野生型phi29 dna聚合酶和已报道的部分突变体都具有较高的3’-5’外切酶校正能力，使其在体内外的扩增具有较高的保真度。然而，phi29dna聚合酶3’-5’的外切酶活性会造成引物片段降解，导致引物变短且浓度降低，影响引物特异性和扩增效率。另外，在测序信号收集过程中，phi29聚合酶3’-5’的外切酶活性会导致测序峰图产生噪音，影响测序的准确性。所以降低phi29 dna聚合酶3’-5’的核酸外切酶活性，可以提高其扩增效率和测序的准确性，对于phi29 dna聚合酶在测序过程中的应用有重要意义。
2、phi29 dna聚合酶的核酸外切酶结构域包含了exo i、exo ii和exo iii三段保守
技术实现思路
1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种dna聚合酶及其用途，用于解决现有技术中的问题。
2、为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种dna聚合酶，所述dna聚合酶包含如下特征中一种或多种：
3、1)所述dna聚合酶包含野生型phi29 dna聚合酶片段在第65位、第165位或第567位发生一种或多种氨基酸突变所形成的多肽片段；所述野生型phi29 dna聚合酶片段的氨基酸序列如seq id no.7所示；
4、2)与seq id no.7具有90％及以上的序列一致性，以及具有1)限定的所述dna聚合酶的功能的多肽片段。
5、优选地，所述氨基酸突变包含如下特征中的一种或多种：
6、i)酪氨酸突变为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸；
7、ii)亮氨酸突变甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸；
8、iii)苯丙氨酸突变为谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸。
9、本专利技术还提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码前述dna聚合酶。
10、本专利技术还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包含前述多核苷酸和骨架质粒。
11、本专利技术还提供一种细胞，所述细胞含有前述核酸构建体或前述多核苷酸。
12、本专利技术还提供一种组合物，所述组合物包含前述dna聚合酶和至少一种其他成分，所述其他成分包括局部用载体或防腐剂。
13、本专利技术还提供前述dna聚合酶、前述多核苷酸、前述核酸构建体或前述细胞在核酸的扩增或测序中，在制备核酸扩增产品或核酸测序产品的用途。
14、如上所述，本专利技术的一种dna聚合酶及其用途，具有以下有益效果：本专利技术通过分析野生型phi29 dna聚合酶的结构与功能区域(如图1)，针对现有的phi29 dna聚合酶构建了大量的点突变，制备出一系列带有点突变位点的重组phi29 dna聚合酶，并对其进行了包括3’-5’核酸外切酶活性、保真性、聚合酶活性和链置换活性在内的测试分析，从中获得了3’-5’核酸外切酶活性明显降低，且不影响其保真性，同时提高了聚合酶活性与链置换活性的突变体。根据本专利技术制备的dna聚合酶，在应用于dna扩增和测序时，可以在降低错误率的同时提高反应效率，从而实现准确高效的dna聚合。
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1.一种DNA聚合酶，其特征在于，所述DNA聚合酶包含如下特征中一种或多种：
2.根据权利要求1所述的DNA聚合酶，其特征在于，所述氨基酸突变包含如下特征中的一种或多种：
3.根据权利要求2所述的DNA聚合酶，其特征在于，所述氨基酸突变为野生型Phi29 DNA聚合酶在第165位由酪氨酸突变为异亮氨酸；和/或，野生型Phi29 DNA聚合酶在第65位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸；和/或，野生型Phi29 DNA聚合酶在第567位由亮氨酸突变为丙氨酸。
4.根据权利要求1所述的DNA聚合酶，其特征在于，所述DNA聚合酶包含如SEQ ID No.1-6任一所示的肽段。
5.根据权利要求1所述的DNA聚合酶，其特征在于，所述DNA聚合酶包含分泌标签。
6.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1-5任一所述的DNA聚合酶。
7.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包含权利要求6所述的多核苷酸和骨架质粒。
8.一种细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求7所述的核酸构建体或权利要求6所述
9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1-5任一所述的DNA聚合酶和至少一种其他成分，所述其他成分包括局部用载体或防腐剂。
10.权利要求1-5任一所述的DNA聚合酶、权利要求6所述的多核苷酸、权利要求7所述的核酸构建体或权利要求8所述的细胞在核酸的扩增或测序，在制备核酸扩增产品或核酸测序产品中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种dna聚合酶，其特征在于，所述dna聚合酶包含如下特征中一种或多种：
2.根据权利要求1所述的dna聚合酶，其特征在于，所述氨基酸突变包含如下特征中的一种或多种：
3.根据权利要求2所述的dna聚合酶，其特征在于，所述氨基酸突变为野生型phi29 dna聚合酶在第165位由酪氨酸突变为异亮氨酸；和/或，野生型phi29 dna聚合酶在第65位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸；和/或，野生型phi29 dna聚合酶在第567位由亮氨酸突变为丙氨酸。
4.根据权利要求1所述的dna聚合酶，其特征在于，所述dna聚合酶包含如seq id no.1-6任一所示的肽段。
5.根据权利要求1所述的dna聚合酶，其特征在于，所述dn...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴凡，胡春瑞，王姝，艾巩丽，陈昌，
申请(专利权)人：上海近观科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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