【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于寡核苷酸固相合成，具体涉及一种二烷基膦酸在寡核苷酸合成中的应用。
技术介绍
1、寡核苷酸在医药、保健品和食品加工等领域的应用研究广泛，也可作为dna合成的引物（primer）、基因探针（probe）等，在现代分子生物学研究中具有广泛的用途。寡核苷酸药物具有靶向性、可修饰性和高生物安全性。尤其是近年来，随着核酸药和基因疗法等技术的快速发展，目前对寡核苷酸产品的质量要求更加严格，对产品数量的需求也日益增加。
2、寡核苷酸合成在原理上是将亚磷酰胺单体逐步添加到生长链的5’-末端，直到组装出所需的序列。现有技术基本采用固相亚磷酰胺三酯合成法，以可控孔径玻璃珠、改性硅胶、或树脂装填的合成柱作为固相载体，亚磷酰胺单体通过脱保护、偶联、盖帽和氧化步骤循环进行，合成到所需序列后，通过浓氨水将合成的寡核苷酸序列从固相载体上切割下来，磷酸根上的氰乙基和核碱基上的保护基团也在此切割过程中被去除。
3、通常情况下，商用的亚磷酰胺单体5’-羟基端受到二甲氧基三苯甲基（dmtr）的保护，5’-端的dmtr在酸的作用下发生裂解，形成游离的dmtr+自由基，呈现出橙红色，5’-端暴露出羟基，在活化剂的作用下与下一个单体的3’-端亚磷酸基团发生缩合反应，少量未反应的载体上的核苷酸链的5’-羟基会在后续的循环中参加反应，生成少一个碱基的核苷酸链，因此需要在反应后进行封闭即盖帽过程。偶合反应形成的三价亚磷酸酯键很不稳定，用氧化剂将三价磷氧化成稳定的五价磷。依此步骤循环，最终得到一个全长寡核苷酸片段粗品。用新鲜的浓氨水把最终得到一
4、现有技术寡核苷酸序列合成的过程中主要会产生如下类型的杂质：截短的序列（short mer sequences）n-x，其中n代表全序列，x表示在全序列的基础上减少核苷单体的序列，如n-1代表比全序列n少一个亚磷酰胺单体的序列，n-2代表全序列n少两个亚磷酰胺单体的序列；更长的序列（longmer sequences）n+x，其中n代表全序列，如n+g表示在全序列的基础上额外增加了鸟苷，n+a表示在全序列的基础上额外增加了腺苷；胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶脱氨基引起的杂质；其他杂质，如序列异构体等。二氯乙酸在切割5’-羟基保护基时，还会有极少量的磷酸二酯键断裂，因为这些杂质分子质量及电荷性质与目标产品的相关性能差异小，很难分离纯化，随着核苷序列不断增长，该影响会被逐渐放大，产物的产率及纯度将会大大降低。同时，二氯乙酸在脱除5’-羟基保护基时，还会和核苷单体其他位置的活性基团反应，生成二氯乙酸酯、二氯乙酰胺等杂质，一些经过特殊修饰性核苷在二氯乙酸的条件下极易发生去嘌呤化产物。
5、此外，根据现有技术，在固相合成过程中，脱保护步骤使用质子酸去除5’-端保护羟基的二甲氧基三苯甲基（dmtr）基团。现有技术中所用的质子酸多为多卤代有机酸（诸如二氯乙酸或三氯乙酸），在反应结束后生成的dmtr+在无水乙腈的洗脱下随溶剂流出，而生成的含氯有机物处理较为困难。目前，处理上述含氯有机物的的常用方法主要有蓄热式燃烧分解技术（rto）和活性炭吸附法。由于含氯有机物的成分十分复杂，在燃烧时极易产生一类毒性极强的有机化合物二噁英。二噁英类化合物的结构相当稳定，半衰期较长，人体仅暴露一次，该化合物就能在体内长期存留。如果长期接触二噁英，还会导致体内蓄积，进而出现氯痤疮、肝脏病变、细胞癌变，甚至死亡等严重后果。此外，在高温燃烧过程中需要消耗大量的能量，这也会增加经济成本。另外一种处理含氯有机废弃物的方式为活性炭吸附，活性炭吸附具有不耐高温、在湿润的条件下不能保持很好的吸附能力、易燃、较快达到饱和吸附而失去效用等缺点，且吸附完成后产生二次固体或液体污染物。
技术实现思路
1、针对现有技术中使用二氯乙酸等含氯的质子酸在合成寡核苷酸中作为脱除剂时会产生多种杂质降低目标产品收率和纯度，以及含氯有机酸带来的含氯废弃物存在后处理困难等问题。本专利技术通过使用二烷基膦酸代替二氯乙酸等含氯的质子酸在合成寡核苷酸中作为脱除剂，有效地提高目标寡核苷酸序列产品的纯度和收率，同时克服现有技术中后处理的问题。
2、具体地，本专利技术提供一种二烷基膦酸在寡核苷酸合成中的应用，所述二烷基膦酸结构式如式ⅰ所示；
3、
4、其中，r1、r2分别独立为烷基，优选c1~c18烷基，更优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、1-甲基丙基(仲丁基)、2-甲基丙基(异丁基)、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基，2,4,4-三甲基戊基中的一种，最优选r1、r2均选自2,4,4-三甲基戊基。
5、本专利技术还提供一种寡核苷酸的合成方法，所述方法包括，上述式ⅰ所示的二烷基膦酸作为寡核苷酸中间体化合物5’-端羟基保护基的脱除剂。
6、本专利技术还提供了一种寡核苷酸合成中脱除剂二烷基膦酸的回收方法，其包括如下步骤：
7、1）收集合成寡核苷酸序列过程中每次循环中脱保护步骤的含二烷基膦酸的回收液；
8、2）将收集的回收液体在一定的温度条件下与无机碱水溶液反应；
9、3）分离上述反应液，水相用无机酸酸化，酸化后分离出有机相；
10、4）有机相减压蒸馏回收二烷基膦酸。
11、本专利技术所描述的寡核苷酸合成原理是本领域众所周知的。如今，大规模的寡核苷酸合成是使用计算机控制的合成仪以自动化方式进行的。
12、本专利技术的有益效果：
13、1、本专利技术首次公开使用二烷基膦酸代替二氯乙酸等作为脱除剂，可以在寡核苷酸序列合成过程中选择性的脱除中间体化合物的5’-端羟基保护基，减少杂质生成，提高目标寡核苷酸产物的纯度和收率。
14、2、本专利技术二烷基膦酸脱5’-端羟基保护基dmtr后，体系的有机相主要含有dmtroh和二烷基膦酸，仅需将其中的dmtroh杂质除去即可回收二烷基膦酸，可以实现二烷基膦酸的循环利用。
15、3、本专利技术避免了含氯有机废弃物的产生，减少环境污染和大大降低成本，可以大规模低成本的合成寡核苷酸，满足市场需求，具有更好的应用前景。
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1.一种二烷基膦酸在寡核苷酸合成中的应用，其特征在于，所述的二烷基膦酸结构如式Ⅰ所示；
2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，R1，R2分别独立为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、1-甲基丙基(仲丁基)、2-甲基丙基(异丁基)、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基，2,4,4-三甲基戊基中的一种或多种。
3.一种寡核苷酸的合成方法，包括如下步骤：脱保护、冲洗、偶联、氧化、盖帽和切割；其特征在于，其中所述的脱保护步骤中，脱除5’-羟基保护基的脱除剂为二烷基膦酸，其结构如式Ⅰ所示，
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述二烷基膦酸在有机溶剂中的质量浓度为1%~20%。
5.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述的脱除保护基的过程中，加入二烷基膦酸的摩尔量相对于含5’-羟基保护基中间体的摩尔比为：1～200:1。
6.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述5’-羟基保护基为对
7.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于，进一步包括脱除5’-羟基保护基团后对二烷基膦酸的回收工艺。
8.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于，所述的二烷基膦酸试剂的回收包括如下步骤，
9.根据权利要求8所述的合成方法，其特征在于，所述的无机碱为浓度30%~42%的氢氧化钠水溶液。
10.根据权利要求8所述的合成方法，其特征在于，所述的反应温度为50~150℃。
11.根据权利要求8中所述的合成方法，其特征在于，在所述酸化水相的无机酸为硫酸或盐酸。
...【技术特征摘要】
1.一种二烷基膦酸在寡核苷酸合成中的应用，其特征在于，所述的二烷基膦酸结构如式ⅰ所示；
2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，r1，r2分别独立为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、1-甲基丙基(仲丁基)、2-甲基丙基(异丁基)、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基，2,4,4-三甲基戊基中的一种或多种。
3.一种寡核苷酸的合成方法，包括如下步骤：脱保护、冲洗、偶联、氧化、盖帽和切割；其特征在于，其中所述的脱保护步骤中，脱除5’-羟基保护基的脱除剂为二烷基膦酸，其结构如式ⅰ所示，
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述二烷基膦酸在有机溶剂中的质量浓度为1%~20%。
5.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述的脱除保护基的过程中，加入二烷基膦酸的摩尔量相对于含5’-羟基保护基中间体的摩尔比为：1～...
【专利技术属性】
技术研发人员：余旺旺，梁雷明，田强，刘旭东，王晓宇，
申请(专利权)人：北京瑞博奥医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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