【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学及基因组学检测，具体涉及一种利用forced-pcr-rflp检测creg1基因单核苷酸多态性的方法及其应用。
技术介绍
1、糖尿病被认为是世界上第五大严重危害人类健康的疾病，其中90%为非胰岛素依赖型糖尿病，又称为ii型糖尿病。该病属于复杂的代谢紊乱性疾病，其发病机制复杂，是遗传和环境互作的结果，其中遗传多态性可能是影响个体间疾病易感性的主要因素。由于ii型糖尿病的早期临床症状不明显，往往使患者延误最佳的治疗时机。因此，寻找和鉴定出人类基因组中与ii型糖尿病相关的遗传分子标记，将有利于该疾病的早期筛查和诊断，及时控制病程的进展。
2、基于分子标记而发展起来的诊断技术能够准确地检测出与人类复杂疾病相关的变异位点，是疾病早期筛查和诊断的有效方法。应用分子标记诊断首先是在dna水平上检测与疾病临床检测指标密切相关的遗传标记，其次是建立该遗传多态性的快速检测方法，最终实现分子标记检测方法在疾病早期诊断和易感人群筛查中的应用。
3、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，snp）是人类基因组中最常见的遗传分子标记之一。单核苷酸多态性主要指在基因组水平上由单个核苷酸突变所引起的dna序列多态性。snp 在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。研究表明，基因中的snp位点与人类疾病的遗传易感性有密切关系，如乳腺癌易感基因brca1与brca2编码区的snp位点。限制性片段长度多态性聚合酶链反应（p
4、e1a激活基因的细胞抑制因子1（cellular repressor of e1a-stimulated gene1，creg1）是一种小糖基化蛋白，广泛表达于多种细胞和组织中。前期研究报道，creg1在心脏中高表达，对于心肌细胞的正常功能至关重要；近期研究发现，过表达creg1能够通过调节自噬影响糖尿病的进程及其并发症ii型糖尿病心肌病的发生发展。此外，creg1还可以通过nf-κb信号通路调节炎症反应，进而抑制糖尿病患者的胰岛素抵抗作用。由此可见，creg1基因与糖尿病的发生密切相关。
5、目前，国内外对creg1基因的研究主要集中在其功能和调控机制方面，关于creg1基因遗传变异及其与ii型糖尿病的相关性尚未见报道。因此，开展creg1基因的多态性研究十分必要，在creg1基因序列中鉴定出与ii型糖尿病相关的分子标记，用于ii型糖尿病的早期筛查和诊断，具有重大的实际意义。
技术实现思路
1、针对现有技术的以上不足，本专利技术的目的之一是提供利用forced-pcr-rflp检测creg1基因单核苷酸多态性的方法，利用强制引入突变的（forced）pcr-rflp，针对snp位点两侧的序列信息，设计出特定的引入特定的forced引物，进而实现对所有snp类型的准确分型，大大提高了原有pcr-rflp的普适性。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：利用forced-pcr-rflp检测creg1基因单核苷酸多态性的方法，以糖尿病患者和正常人的血液基因组dna为模板，在 taq dna聚合酶、缓冲环境、mg＋＋、dntps存在的情况下，利用特定设计的用于引入酶切位点的引物对p进行pcr扩增，然后利用限制性内切酶对其进行酶切，再通过电泳检测即可准确鉴定待测样本的单核苷酸多态性；
3、所述的特定设计的用于引入酶切位点的引物对p为：
4、上游引物p-f：5’-gggctggaagaggcatcaga-3’ 20 nt
5、下游引物p-r：5’-caaaaggaggaaaattgggtt gat-3’ 24 nt
6、引物p-r中带有下划线的碱基 g为引入错配碱基，目的是引入 dpnii的酶切位点；
7、pcr扩增后，将pcr产物用限制性内切酶 dpnii进行消化，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定creg1基因第-2697位的碱基多态性。
8、进一步，所述的pcr扩增条件为：20 μl反应体系，其包括0.625u taqdna聚合酶，2×buffer 10 μl（内含mg++、dntps等），0.45 μl基因组dna，10 pmol/μl的上、下游引物各0.5 μl和灭菌超纯水8.3 μl；所述的pcr反应程序为：95oc预变性5 min；94oc变性30s，54.5oc退火30s，72oc延伸35s，35个循环；72oc延伸10 min。
9、进一步，所述的琼脂糖凝胶的浓度都为3.0%。
10、进一步，检测到的creg1基因启动子区多态性为：启动子区基因组第-2697位g>a突变。
11、更进一步，通过电泳判定creg1基因第-2697位的碱基多态性为：aa基因型表现为268 bp条带；tg基因型表现为268、246和22 bp条带；gg基因型表现为246和22 bp条带。
12、本专利技术的目的之二是提供所述的creg1基因单核苷酸多态性标记在ii型糖尿病的早期筛查和诊断中的应用：creg1基因单核苷酸多态性位点作为分子标记用于ii型糖尿病的临床检测。
13、进一步，包括以下步骤：
14、（1）提取ii型糖尿病患者和正常人的血液基因组dna；
15、（2）采用所述的forced-pcr-rflp方法检测不同群体中creg1基因-2697位的单核苷酸多态性；
16、（3）根据forced-pcr-rflp的检测结果分析creg1基因-2697位的多态位点在ii型糖尿病群体中的易感基因型，建立准确的分子诊断体系，应用于ii型糖尿病的临床检测。
17、更进一步，包括以下步骤：
18、（1）采用dna池测序技术筛查creg1基因的单核苷酸多态性位点，检测到的多态位点为启动子区-2697位g>a的突变；
19、（2）利用forced-pcr-rflp技术，检测creg1基因的单核苷酸多态性位点在ii型糖尿病患者和正常人中的分布情况，鉴定出与ii型糖尿病易感性相关的基因型；
20、（3）利用spss 2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.利用Forced-PCR-RFLP检测CREG1基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：以糖尿病患者和正常人的血液基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg＋＋、dNTPs存在的情况下，利用引入酶切位点的引物对P进行PCR扩增，然后利用限制性内切酶对其进行酶切，再通过电泳检测即可准确鉴定待测样本的单核苷酸多态性；
2.根据权利要求1所述的利用Forced-PCR-RFLP检测CREG1基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的PCR扩增条件为：20 μL反应体系，其包括0.625U Taq DNA聚合酶，2×Buffer 10 μL，0.45 μL基因组DNA，10 pmol/μL的上、下游引物各0.5 μL和灭菌超纯水8.3 μL；所述的PCR反应程序为：95oC预变性5 min；94oC变性 30s，54.5oC退火30s，72oC延伸35s，35个循环；72oC延伸10 min。
3.根据权利要求1所述的利用Forced-PCR-RFLP检测CREG1基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶的浓度为3.0%。
...【技术特征摘要】
1.利用forced-pcr-rflp检测creg1基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：以糖尿病患者和正常人的血液基因组dna为模板，在taq dna聚合酶、缓冲环境、mg＋＋、dntps存在的情况下，利用引入酶切位点的引物对p进行pcr扩增，然后利用限制性内切酶对其进行酶切，再通过电泳检测即可准确鉴定待测样本的单核苷酸多态性；
2.根据权利要求1所述的利用forced-pcr-rflp检测creg1基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的pcr扩增条件为：20 μl反应体系，其包括0.625u taq dna聚合酶，2×buffer 10 μl，0.45 μl基因组dna，10 pmol/μl的上、下游引物各0.5 μl和灭菌超纯水8.3 μl；所述的pcr反应程序为：95oc预变性5 min；94oc变性 30s，54.5oc退火30s，72oc延伸35s，35个循环；72oc延伸10 min。
3.根据权利要求1所述的利用forced-pcr-rflp检测creg...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐瑶，陈纪骅，熊胜，齐江发，卓情，邓逍童，王桢荣，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：
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