【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫细胞治疗领域，具体涉及一种增加嵌合抗原受体t细胞中央记忆型表型比例的方法。
技术介绍
1、嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor modified t cells，car-t)是将一个人工合成的car分子(chimeric antigen receptor)表达在t细胞膜上，使t细胞以抗原抗体结合的方式识别并杀伤肿瘤细胞。car分子包括胞外的抗原结合域(能特异性识别靶抗原的单克隆抗体来源的单链抗体序列)、铰链区、跨膜区和胞内的信号段(包括共刺激域和cd3ζ链)。car-t技术在血液瘤的治疗效果显著，在部分血液瘤的治疗上已取代化疗成为一线治疗方案。然而，目前高昂的治疗费用及复发率高的现状，限制了该技术在更广大患者中的应用价值。
2、car-t治疗后高复发率的现状，除了与肿瘤细胞通过抗原丢失、通过肿瘤微环境的影响使t细胞无能(anergy)等机制发生免疫逃逸外，另外一个重要机制是与过继性回输的car-t细胞在体内存活时间短暂有关。少量、长期在体内存活的car-t可起到免疫监视的作用，在控制肿瘤残留病灶、预防复发上起到重要作用，相反，体内存活时间短的car-t产品，临床疗效往往不佳，且在短暂的疾病缓解后往往迅速复发。文献报道[1]，car-t回输后在体内存留时间为数周-数年，而长的car-t体内存活时间往往也伴随着良好的临床治疗效果：完全缓解(complete remission，cr)，甚至是严格完全缓解(stringentcr，scr)。因此，如何提高car-t细胞在体
3、初次接触抗原后，静止的初始t细胞(t cells，tn)增殖分化为记忆性干细胞样t细胞(stem memory t cells，tscm)，tscm在外周血中约占2％-4％，它们的基因谱介于tn细胞和tcm细胞之间[2]。tscm除了可继续分化为中央记忆型t细胞(central memory t cells，tcm)外，还与干细胞(stem cell)一样具有复制、自我更新的功能，是t细胞在体内长期存在、再次遇到相同抗原的刺激时能迅速增殖、分化、产生终末活化的cd8+效应t细胞(effectort cells，te)的基础。除了分化为效应记忆t细胞(effector memory t cells，tem)外，一部分存在于外周组织中的tcm分化为组织驻留记忆t细胞(tissue resident memory tcells)，长期存在于外周组织中，起着外周免疫监视的作用。tem继续分化为te后，分泌大量细胞因子和细胞毒性分子，从而杀伤病原体或肿瘤细胞，发挥免疫清除的功能。在上述t细胞分化过程中，获得效应功能的同时，不断失去了自我更新和存活能力[3]，最后只有少数长期存活的记忆性t细胞具有记忆功能，当再次遇到同一抗原刺激时，记忆性t细胞迅速发生活化、增殖、分化为te[4]。
4、从t细胞的分化、成熟过程中可见，记忆性t细胞尤其是tscm和tcm是t细胞在体内长期存留、发挥免疫监视和清除(由te执行)的基础，如果在体外人工培养t细胞时，优化生产工艺、尽量提高t细胞混合物(t细胞分化的不同阶段的产物)中tscm和tcm的比例，将极大提高t细胞回输后在体内存留的时间、提高肿瘤治疗效果。支持此观点的是，在小鼠模型中发现，tscm细胞比tcm细胞和tem细胞具有更强的抗肿瘤作用[5]。过继回输主要为tem表型eb病毒(ebv)特异性t细胞后，这些细胞在输注9年后仍可检测到[6]；表达腺苷脱氨酶(ada)的tscm细胞在输注12年后仍持续存在并保持其分化潜能[7]。除了可在体内长期存留的优势，与tscm和tem相比，tcm可能更容易进行病毒转导[8]。记忆性t细胞的以上优势使其成分及占比成为过继回输的car-t细胞产品治疗效果的决定性因素。
5、目前，业内通常使用cd3/cd28抗体类激活剂(例如dynabeadstmcd3/cd28)激活t细胞，但该方法可能发生激活不足/过度，尤其是在一次性封闭系统中制备car-t细胞的情况下，容易发生t细胞活化不足导致病毒转导效率低/t细胞过度激活后car-t功能抑制；并且cd3/cd28抗体类激活剂试剂还面临昂贵等问题。因此，目前急需一种传统的t细胞活化的替代方法，使t细胞的活化工序不仅降低成本，并且能增加car-t细胞最终产品中中央记忆性表型比例，可增加car-t在体内存活的时间，使之起到长期免疫监视(immunesurveillance)的功能，从而达到降低肿瘤患者car-t治疗后复发率的目的。
6、[1]porter dl,hwang wt,frey nv,et al.chimeric antigen receptor t cellspersist and induce sustained remissions in relapsed refractory chroniclymphocytic leukemia[j].sci transl med.2015sep 2；7(303):303ra139.
7、[2]gattinoni l,lugli e,ji y,et al.a human memory t cell subset withstem cell-like properties[j].nat med,2011,17(10):1290-1297.
8、[3]gattinoni l,restifo np.moving t memory stem cells to theclinic.blood[j].2013jan24；121(4):567-568.
9、[4]youngblood b,hale js,ahmed r.t-cell memory differentiation:insights from transcriptional signatures and epigenetics[j].immunology.2013jul；139(3):277-284.
10、[5]klebanoff ca,gattinoni l,palmer dc,et al.determinants ofsuccessful cd8+t-cell adoptive immunotherapy for large established tumors inmice[j].clin cancer res.2011aug15；17(16):5343-5352.
11、[6]heslop he,slobod ks,pule ma,et al.long-term outcome of ebv-specific t-cell infusions to prevent or treat ebv-related lymphoproliferativedisease in transplant recipients[j].blood.2010feb 4；115(5):925-35.<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种增加嵌合抗原受体T细胞中央记忆型表型比例的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的活化所用的培养基或步骤(3)中所述的扩增所用的培养基为淋巴细胞培养基。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的淋巴细胞培养基中含有白细胞介素，所述白细胞介素的终浓度为5-15ng/mL，所述白细胞介素选自IL-7、IL-15或IL-2中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的淋巴细胞培养基为含有终浓度为10ng/mLIL-7和10ng/mLIL-15的淋巴细胞培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的慢病毒包括BCMACAR慢病毒，所述BCMACAR慢病毒通过慢病毒穿梭质粒与慢病毒包装质粒共转染293T宿主细胞得到。
6.权利要求1-5任一项所述的方法在制备中央记忆型表型比例增加的嵌合抗原受体T细胞的中的应用。
7.权利要求1-5任一项所述的方法制备得到的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述的嵌合
8.权利要求7所述的嵌合抗原受体T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.一种肿瘤诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求7所述的嵌合抗原受体T细胞。
10.一种治疗或预防肿瘤的药物，其特征在于，所述的药物包括权利要求7所述的嵌合抗原受体T细胞。
...【技术特征摘要】
1.一种增加嵌合抗原受体t细胞中央记忆型表型比例的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的活化所用的培养基或步骤(3)中所述的扩增所用的培养基为淋巴细胞培养基。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的淋巴细胞培养基中含有白细胞介素，所述白细胞介素的终浓度为5-15ng/ml，所述白细胞介素选自il-7、il-15或il-2中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的淋巴细胞培养基为含有终浓度为10ng/mlil-7和10ng/mlil-15的淋巴细胞培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所...
【专利技术属性】
技术研发人员：王冰，刘杨，钱鲍薇，朱敏，李亚明，王海峰，
申请(专利权)人：上海佰炼生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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