【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物材料，具体涉及一种可用于细胞培养或小鼠胚胎早期体外培养的聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶及该复合水凝胶的制备方法和应用。
技术介绍
1、体外胚胎培养技术(in vitro culture，ivc)指的是把胚胎放在专门容器里置于一定的条件下，如37℃，有时加入人工混合气体：5％co2、5％o2、90％n2或5％co2、95％空气等，使胚胎体外持续发育，体外胚胎培养技术为人类生殖发育领域提供了非常宝贵的经验。胚胎体外培养一个重要目的是为胚胎(囊胚)提供一个模拟子宫内膜的优良的环境，以获得具有高植入潜能、高质量的健康胚胎。目前常见的体外胚胎培养是在特殊的培养皿中进行，这类培养皿的材质大多是聚乙烯或者聚丙烯。然而无论从化学成分还是力学性能角度分析，这类培养皿与子宫内膜相差巨大。相比于聚乙烯或者聚丙烯，水凝胶是由大量水和三维聚合物网络组成的复合材料。通常这些聚合物包括糖类高分子、蛋白、核糖核酸等生物分子。水凝胶不仅在化学成分上能够接近子宫内膜，而且它具有较好力学性能和生物相容性，无疑是一种更好的适用于胚胎体外培养的材料。
2、哺乳动物的卵母细胞在受精后，会经历两细胞期、四细胞期、八细胞期、桑椹胚期和囊胚期，之后胚胎会开始与母体子宫接触进行交互并着床。其中，前期的发育过程十分重要，严重影响了其是否可以发育成囊胚以及后续能够在体外培养的时间。除了一些常见的生化因素对这一过程会产生巨大的影响，力学因素也是不可忽视的一个重要因素。已有的研究结果表明，哺乳动物子宫内膜的最理想的弹性模量应在1kpa左右，子宫内膜的弹性模
技术实现思路
1、基于
技术介绍
中的原因，本专利技术有必要提供一种聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶，该聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶的力学性质可调控，生物相容性高，便于大量制备且价格低廉。该复合水凝胶不仅可用于体外细胞培养，更显著的是其可以应用于基体刚度变化下的胚胎早期体外培养，尤其是对于囊胚期之后的着床阶段以及后续培养。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、本专利技术第一个方面提供了一种聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶，其含有聚丙烯酰胺水凝胶网络和穿插于其中的胶原蛋白网络，所述胶原蛋白网络通过酰胺键与所述聚丙烯酰胺水凝胶网络交联。
4、该复合水凝胶的生物相容性高，可用于体外细胞培养，通过调整聚丙烯酰胺和胶原蛋白的配比能够构建不同基体刚度变化的体外培养平台，非常适合应用于体外细胞培养和胚胎早期体外培养，特别是囊胚期之后的着床阶段以及后续培养。
5、本专利技术第二方面提供了一种聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
6、将丙烯酰胺、交联剂、热引发剂于水中混合均匀，获得透明溶液；
7、将所述透明溶液与胶原蛋白混合均匀后脱气，获得反应液；
8、向所述反应液中加入催化剂，经自由基聚合反应，获得聚丙烯酰胺复合水凝胶；
9、将所述聚丙烯酰胺复合水凝胶置于交联溶液中进行充分交联后透析，获得聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶。
10、具体的说，丙烯酰胺通过自由基聚合反应形成聚丙烯酰胺水凝胶，聚丙烯酰胺水凝胶中含有的氨基进一步的和胶原蛋白中的羧基反应，使得胶原蛋白和聚丙烯酰胺水凝胶通过酰胺键交联，同时胶原蛋白中自身的羧基和氨基也会发生反应形成胶原蛋白网络，最终形成的复合水凝胶为聚丙烯酰胺水凝胶网络和穿插于其中的胶原蛋白网络，且胶原蛋白网络通过酰胺键与聚丙烯酰胺水凝胶网络交联(图1)。
11、进一步方案，本申请中可通过调整丙烯酰胺和交联剂的配比调整复合水凝胶中聚丙烯酰胺占比，进而对复合水凝胶的刚度或弹性模量进行调整，故具体的配比可根据需要进行选择，没有特别的限制。在申请的一些具体的实施例中，所述透明溶液中，丙烯酰胺和水的质量比为(0.03～0.2)：1，丙烯酰胺和交联剂的质量比为1：(0.01～0.02)。
12、进一步方案，本申请中所采用的交联剂、热引发剂和催化剂均为本领域中常规用于丙烯酰胺交联得到聚丙烯酰胺水凝胶的常规助剂，在本申请的一些具体的实施方式中，所述交联剂为n，n'-亚甲基双(丙烯酰胺)，所述热引发剂为过硫酸铵；和/或，所述催化剂为四甲基乙二胺。但并不限于此。
13、进一步方案，对于自由基聚合反应的温度，具体可根据热引发剂的种类进行调整，但同时需要注意该反应温度不会引起胶原蛋白变性，优选的，自由基聚合反应温度为37℃，反应时间可根据具体需要进行调整，在本专利技术一些具体的实施方式中，反应时间为10min。
14、进一步方案，所述胶原蛋白为i型胶原蛋白；优选的，所述i型胶原蛋白为牛i型胶原蛋白；优选的，所述牛i型胶原蛋白的分子量为300kda以上；更优选的，所述牛i型胶原蛋白的分子量为300-320kda。
15、进一步方案，本申请中可通过调整胶原蛋白的添加量，在小范围内对复合水凝胶的力学性质进行微调，故其具体的含量没有特别的限定，在本申请的一些具体的实施方式中，所述牛i型胶原蛋白与透明溶液中水的质量比为(0.01～0.06)：1。
16、进一步方案，本申请中所述的交联溶液是指能够使得胶原蛋白中的羧基与聚丙烯酰胺中的氨基发生酰胺化反应形成酰胺键的反应液，在本申请的一些具体的实施例中，所述交联溶液为edc/nhs溶液，其中，edc为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，nhs为n-羟基丁二酰亚胺。
17、进一步方案，所述edc/nhs溶液中，edc和nhs的摩尔质量比为(2～4):1；
18、进一步方案，所述edc/nhs溶液的ph为5.0～6.0。
19、进一步方案，本申请中交联和透析的时间没有特别的限定，可根据具体的反应物添加量、配比等进行调整，在本申请的一些实施例中，所述交联的时间为2-8h。所述透析的时间为0.5-3d。
20、本专利技术第三方面提供了如本专利技术第一方面所述的聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶或采用本专利技术第二方面所述的制备方法制得的聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶在细胞培养或胚胎早期体外培养中的应用；进一步方案，所述胚胎为小鼠胚胎。
21、本专利技术第四方面提供了一种不同基底刚度的体外培养平台，基于不同刚度的聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶建立，所述聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶采用本专利技术第二方面所述的制备方法，并通过调整丙烯酰胺、交联剂和胶原蛋白的比例获得，在本申请的一些典型的实施例中，本申请中的聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶的弹性模量可在5～400kpa调节。
22、进一步方案，所述体外培养平台为细胞培养平台或胚胎早期体外培养平台。优选的，所述胚胎为小鼠胚胎。
23、可本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶，其特征在于，其含有聚丙烯酰胺水凝胶网络和穿插于其中的胶原蛋白网络，所述胶原蛋白网络通过酰胺键与所述聚丙烯酰胺水凝胶网络交联。
2.一种聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的聚丙烯酰胺-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述交联剂为N，N'-亚甲基双（丙烯酰胺），所述热引发剂为过硫酸铵；
4.如权利要求2所述的聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白为I型胶原蛋白；
5.如权利要求2所述的聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述交联溶液为EDC/NHS溶液；
6.如权利要求2所述的聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述交联的时间为2-8h。
7.如权利要求2所述的聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述透析的时间为0.5-3d。
8.如权利要求1所述的聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶或采用权利要求2-7任一
9.一种不同基底刚度的体外培养平台，其特征在于，基于不同刚度的聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶建立，所述聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶采用权利要求2-7任一项所述的制备方法，并通过调整丙烯酰胺、交联剂和胶原蛋白的比例获得。
10.如权利要求9所述的体外培养平台，其特征在于，所述体外培养平台为细胞培养平台或胚胎早期体外培养平台；
...【技术特征摘要】
1.一种聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶，其特征在于，其含有聚丙烯酰胺水凝胶网络和穿插于其中的胶原蛋白网络，所述胶原蛋白网络通过酰胺键与所述聚丙烯酰胺水凝胶网络交联。
2.一种聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的聚丙烯酰胺-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述交联剂为n，n'-亚甲基双（丙烯酰胺），所述热引发剂为过硫酸铵；
4.如权利要求2所述的聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白为i型胶原蛋白；
5.如权利要求2所述的聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述交联溶液为edc/nhs溶液；
6.如权利要求2所述的聚丙烯酰胺枝接胶原蛋白复...
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