【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物催化领域，具体涉及一种自组装生物催化剂及其在合成l-草铵膦中的应用。
技术介绍
1、草铵膦，即4-[羟基(甲基)膦酰基]-d,l-高丙氨酸(4-[hydroxy(methyl)phosphono]-d,l-homoalanine，ppt)是一类含磷的氨基酸类除草剂。草铵膦主要有两种手性异构体，分别为d构型和l构型，但是只有l构型具有除草活性，l-草铵膦具有活性高、吸收好、杀草谱广、低毒、环境兼容性好等特点。
2、草铵膦的合成主要分为生物发酵法(利用微生物分解双丙氨酰磷而产生)和化学合成法两大类：生物发酵法虽然具有反应条件较简单、产物收率相对较高且产物易分离纯化等优点，但其产量小、成本很高；化学合成法主要以甲基二氯化磷或亚磷酸酯为起始原料，通过烷基化、重排、氰胺化、铵化、酸解、纯化等一系列的反应最终生成磷酸酯，然后与某些氨基衍生物发生反应制得草铵膦。用生物方法合成l-草铵膦，草铵膦最开始源于生物法合成的双丙氨膦，由于双丙氨膦可看成是草铵膦的母体，科研工作者通过生物方法合成草铵膦。以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(ppo)为底物，同时辅酶nad(p)h以及氨基供体作为辅底物，氨基酸脱氢酶还原胺化合成l-草铵膦。
3、以谷氨酸脱氢酶(glufosinate dehydrogenase，gfdh)为催化剂，不对称催化2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸(2-oxo-4-[(hydroxy)(-methyl)phosphinyl]butyricacid，ppo)生成l-草铵膦，构建了甲酸脱
4、甲酸脱氢酶(psefdh)来源为pseudomonas sp.101的野生型fdh对nad+的催化效率最高，其突变体psefdh a196g在目前已报道的nad+依赖型fdh中催化效率最高。甲酸价格低廉，甲酸脱氢酶能催化甲酸盐生成二氧化碳，易被排出反应体系，无污染；同时将nad(p)+还原为nad(p)h，是氧化还原生物合成中辅酶再生体系的关键酶。
5、氧化还原酶大多依赖辅酶nadph或nadh进行催化反应，是手性化合物合成重要生物催化剂，然而辅酶会随着产物的生成而消耗，同时nad(p)h的高成本，价格昂贵，阻碍了其大规模生产，这就促使我们找到一种方法使得辅酶的浪费减少。目前常用的方法有化学法和生物法，化学法存在化学工艺复杂，制备成本高，污染严重等问题，酶法制备存在酶纯化成本高，稳定性差，难以放大等问题，为了开发一种高效的辅因子的生产方法，本专利技术采用了多酶自组装的技术。
6、基于多酶组装技术构建高效催化的超分子复合体系是酶催化领域的研究热点。通过多酶组装可实现底物通道作用，即反应中间产物不经主体溶剂扩散，直接从一个酶的活性位点传递至下一个酶的活性位点，有效防止中间体在扩散或竞争途径中损失，提高酶级联反应转化效率。自组装蛋白是一种缩短多种酶之间距离的技术，适用于需要辅因子的工业生产。然而目前尚未有利用自组装蛋白技术应用于谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶双酶共表达的研究。
技术实现思路
1、本专利技术目的是提供一种自组装生物催化剂在l-草铵膦中的应用，所述生产l-草铵膦的方法是利用谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶自组装蛋白来提高生产nadh的效率，优化辅酶再生体系，为氧化还原反应提供更多的能量。
2、第一方面，本专利技术提供了一种自组装生物催化剂，包括：相连的谷氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶，所述谷氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶通过spycatcher-spytag标签体系相连接，所述谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如seq idno.2所示。
3、进一步地，所述spycatcher连接在谷氨酸脱氢酶的n端，所述spytag连接在甲酸脱氢酶的c端。
4、进一步地，所述spycatcher-spytag标签体系与谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶之间通过两倍的柔性连接肽相连接。
5、第二方面，本专利技术提供了带有spycatcher-spytag标签体系以及柔性连接肽的自组装蛋白的编码基因，所述编码基因包括连接有spycatcher以及柔性连接肽的谷氨酸脱氢酶的编码基因ⅰ；所述编码基因还包括连接有spytag以及柔性连接肽的甲酸脱氢酶的编码基因ⅱ；所述连接有spycatcher以及柔性连接肽的谷氨酸脱氢酶的编码基因ⅰ核苷酸序列如seq id no.3所示，所述连接有spytag以及柔性连接肽的甲酸脱氢酶的编码基因ⅱ核苷酸序列如seq id no.4所示。
6、第三方面，本专利技术提供了一种工程菌，所述工程菌包含上述的编码基因。
7、第四方面，本专利技术提供了所述自组装生物催化剂在合成l-草铵膦中的应用。
8、第五方面，本专利技术提供了所述的工程菌的制备方法，包括以下步骤：
9、(1)构建第一和第二多克隆位点分别为草铵膦脱氢酶与醇脱氢酶的重组表达载体，转化大肠杆菌，获得初始菌株；
10、(2)采用同源重组的方法，将spytag基因和两倍柔性连接肽基因连接到甲酸脱氢酶c端基因一端，采用一步克隆法将spycatcher基因和两倍柔性连接肽基因克隆到谷氨酸脱氢酶n端基因一端，构建得到重组质粒，转入宿主细胞中，构建自组装工程菌。
11、进一步地，所述重组表达载体以质粒petduet为载体；宿主细胞优选大肠杆菌e.coli bl21(de3)。
12、第六方面，本专利技术提供了所述工程菌在合成l-草铵膦中的应用。
13、进一步地，所述应用的途径为：以带spytag标签的甲酸脱氢酶和带spycatcher标签的谷氨酸脱氢酶自组装菌株经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为底物，加入甲酸铵和nad+，以ph值为7～8的缓冲液为反应介质构成反应体系，在20℃-60℃、500-700rpm条件下反应，反应完全，获得l-草铵膦。
14、进一步地，所述反应体系中，所述催化剂的用量以湿菌体总重量计为5～30g/l，所述底物的初始浓度为10～500mm，所述nad+添加量为0～0.4mm，所述甲酸铵的添加量为10～500mm，反应温度为20℃～60℃，反应转速为500～700rpm。
15、进一步地，所述催化剂的用量以湿菌体总重量计为10g/l，所述底物的初始浓度为200mm，所述nad+添加量为0.1mm，所述甲酸铵的添加量为300mm，反应温度为35℃，反应转速为600rpm。
16、本专利技术提供的合成l-草铵膦的方法，以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为反应底物，以甲酸铵为辅酶再生体系的底物，此生物催化剂催化辅酶nad(p)h再生的同时，谷氨酸脱氢酶将2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸催化为l-ppt，甲酸脱氢酶将nad+催化为nadh，最终得到的产物为l-草铵膦和二氧化碳，无需进本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种自组装生物催化剂，其特征在于：包括：相连的谷氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶；所述谷氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶通过SpyCatcher-SpyTag标签体系相连接，所述谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的一种自组装生物催化剂，其特征在于：所述SpyCatcher连接在谷氨酸脱氢酶的N端，所述SpyTag连接在甲酸脱氢酶的C端。
3.根据权利要求1或2任一项所述的一种自组装生物催化剂，其特征在于：所述SpyCatcher-SpyTag标签体系与谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶之间通过两倍的柔性连接肽相连接。
4.如权利要求1所述的自组装生物催化剂在合成L-草铵膦中的应用。
5.如权利要求3所述的自组装生物催化剂的编码基因，其特征在于；
6.一种工程菌，其特征在于；所述工程菌包含如权利要求5所述的编码基因。
7.如权利要求6所述的工程菌的制备方法，其特征在于：
8.如权利要求6或7中任一项所述的工程菌在合成L-草铵膦
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用的途径为：以带SpyTag标签的甲酸脱氢酶和带SpyCatcher标签的谷氨酸脱氢酶自组装菌株经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为底物，加入甲酸铵和NAD+，以pH值为7～8的缓冲液为反应介质构成反应体系，在20℃-60℃、500-700rpm条件下反应，反应完全，获得L-草铵膦。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述反应体系中，催化剂的用量以湿菌体总重量计为5～30g/L，所述底物的初始浓度为10～500mM，所述NAD+添加量为0～0.4mM，所述甲酸铵的添加量为10～500mM。
...【技术特征摘要】
1.一种自组装生物催化剂，其特征在于：包括：相连的谷氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶；所述谷氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶通过spycatcher-spytag标签体系相连接，所述谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.根据权利要求1所述的一种自组装生物催化剂，其特征在于：所述spycatcher连接在谷氨酸脱氢酶的n端，所述spytag连接在甲酸脱氢酶的c端。
3.根据权利要求1或2任一项所述的一种自组装生物催化剂，其特征在于：所述spycatcher-spytag标签体系与谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶之间通过两倍的柔性连接肽相连接。
4.如权利要求1所述的自组装生物催化剂在合成l-草铵膦中的应用。
5.如权利要求3所述的自组装生物催化剂的编码基因，其特征在于；
6.一种工程菌，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：程峰，薛亚平，龚笑笑，邹树平，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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