【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、听力损失是重大的公共卫生问题，估计将影响近15％的学龄儿童和三分之一65岁的人。听力损失最常见的类型是感觉神经性听力损失，这是一类由内耳细胞(诸如耳蜗毛细胞)或从内耳伸出到脑部的神经通路的缺陷引起的听力损失。感觉神经性听力损失通常是获得性的，并且其原因多种多样，包括声创伤、疾病或感染、头部创伤、耳毒性药物和衰老。感觉神经性听力损失也有遗传原因，诸如参与内耳细胞发育和功能的基因的突变。已经鉴定出超过90种此类基因的突变，包括以常染色体隐性、常染色体显性或x连锁模式遗传的突变。
2、破坏耳蜗细胞的发育、存活或完整性的因素，诸如基因突变、疾病或感染、耳毒性药物、头部创伤和衰老，可同样影响前庭细胞，并且因此也与前庭功能障碍有牵涉。的确，携带破坏毛细胞发育或功能的突变的患者可以同时出现听力损失和前庭功能障碍，或单独出现任一病症。前庭感觉细胞的大量丧失会导致人极度虚弱，并可能引发令人恶心的头晕、失衡和丧失能力发作。约35％的40岁及以上的美国成年人表现出平衡障碍，并且这一比例随着年龄的增长而急剧增加，导致日常活动中断，情绪和认知下降，老年人跌倒的发生率增加。
3、因此，需要可用于治疗听力损失或前庭功能障碍的疗法。
技术实现思路
1、本专利技术提供设计用于在内耳中以细胞类型特异性方式表达目标多核苷酸(例如，编码蛋白质的转基因或能被转录以产生抑制性rna的多核苷酸)的核酸载体。这些载体包含可操作地连接至目标多核苷酸并且可操作地连接至能被转录以产生微小rna(
2、在第一方面，本专利技术提供含有第一启动子的核酸载体，所述第一启动子可操作地连接至：(i)能被转录以产生表达产物的第一多核苷酸(例如，能被转录以产生蛋白质或抑制性rna分子的多核苷酸)；和(ii)至少一个能被转录以产生微小rna(mirna)靶序列的多核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个能被转录以产生mirna靶序列的多核苷酸)，其中：所述第一多核苷酸适于在第一内耳细胞类型中表达但不在不同的第二内耳细胞类型中表达；并且从可操作地连接至所述第一启动子的所述至少一个多核苷酸转录的mirna靶序列由在所述第二内耳细胞类型中表达但不在所述第一内耳细胞类型中表达的mirna识别。在一些实施方案中，从所述第一多核苷酸转录的所述表达产物促进所述第一内耳细胞类型向所述第二内耳细胞类型的转化。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸在所述第一内耳细胞类型中表达，但不在所述第二内耳细胞类型中表达。
3、在一些实施方案中，所述载体含有至少两个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)能被转录以产生mirna靶序列的多核苷酸。在一些实施方案中，所述载体含有能被转录以产生第一mirna靶序列的多核苷酸和能被转录以产生第二mirna靶序列的多核苷酸，其中每一mirna靶序列由不同的mirna识别。在一些实施方案中，所述载体还包含能被转录以产生第三mirna靶序列的多核苷酸，其中所述第一mirna靶序列、所述第二mirna靶序列和所述第三mirna靶序列中的每一者由不同的mirna识别。在一些实施方案中，所述载体包含能被转录以产生相同mirna靶序列的多核苷酸的至少两个拷贝(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个拷贝)。在一些实施方案中，所述载体包含能被转录以产生相同mirna靶序列的多核苷酸的至少三个拷贝(例如，3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个拷贝)。在一些实施方案中，可操作地连接至所述第一启动子的能被转录以产生mirna靶序列的每一多核苷酸是相同的。在一些实施方案中，能被转录以产生mirna靶序列的每一多核苷酸位于所述第一多核苷酸的3’。
4、在一些实施方案中，所述载体还包含位于所述第一多核苷酸的3’的wpre序列，并且能被转录以产生mirna靶序列的每一多核苷酸位于所述第一多核苷酸与所述wpre序列之间。
5、在一些实施方案中，能被转录以产生mirna靶序列的每一多核苷酸处于所述第一多核苷酸的3’utr中。在一些实施方案中，能被转录以产生mirna靶序列的每一多核苷酸处于所述第一多核苷酸的5’utr中。
6、在一些实施方案中，可操作地连接至所述第一启动子的能被转录以产生mirna靶序列的每一多核苷酸独立地被表2中列出的mirna靶向。可操作地连接至所述第一启动子的能被转录以产生mirna靶序列的每一多核苷酸独立地被以下之一靶向：mir-183、mir-96、mir-182、mir-18a、mir-100、mir-124a、mir-140、mir-194、mir-135或mir-135b。
7、在一些实施方案中，所述第一内耳细胞类型是耳蜗支持细胞，并且所述第二内耳细胞类型是耳蜗毛细胞或螺旋神经节神经元。在一些实施方案中，所述第二内耳细胞类型是耳蜗毛细胞。在一些实施方案中，所述第二内耳细胞类型是螺旋神经节神经元。
8、在一些实施方案中，所述第一内耳细胞类型是前庭支持细胞，并且所述第二内耳细胞类型是前庭毛细胞或前庭神经节神经元。在一些实施方案中，所述第二内耳细胞类型是前庭毛细胞。在一些实施方案中，所述第二内耳细胞类型是前庭i型毛细胞。在一些实施方案中，所述第二内耳细胞类型是前庭神经节神经元。
9、在一些实施方案中，所述第一内耳细胞类型是前庭ii型毛细胞，并且所述第二内耳细胞类型是前庭i型毛细胞。
10、在一些实施方案中，所述第一内耳细胞类型是前庭ii型毛细胞，并且所述第二内耳细胞类型是前庭神经节神经元。
11、在一些实施方案中，所述第一多核苷酸是编码蛋白质的转基因，是能被转录以产生抑制性rna的多核苷酸，或者编码基因编辑系统的组分。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸是编码蛋白质的转基因。在一些实施方案中，所述转基因是表4中列出的基因的野生型型式。在一些实施方案中，所述转基因是表5中列出的多核苷酸。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸能被转录以产生抑制性rna。在一些实施方案中，所述抑制性rna是sirna、shrna或shrna-mir。在一些实施方案中，所述抑制性rna是靶向sox2的抑制性rna(例如，本文所述的抑制性rna)本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种载体，所述载体包含可操作地连接至以下的启动子：
2.如权利要求1所述的载体，其中从所述第一多核苷酸转录的所述表达产物促进所述第一内耳细胞类型向所述第二内耳细胞类型的转化。
3.如权利要求1或2所述的载体，其中所述第一多核苷酸在所述第一内耳细胞类型中表达，但不在所述第二内耳细胞类型中表达。
4.如权利要求1-3中任一项所述的载体，所述载体包含至少两个能被转录以产生miRNA靶序列的多核苷酸。
5.如权利要求4所述的载体，所述载体包含能被转录以产生第一miRNA靶序列的多核苷酸和能被转录以产生第二miRNA靶序列的多核苷酸，其中每一miRNA靶序列由不同的miRNA识别。
6.如权利要求5所述的载体，所述载体还包含能被转录以产生第三miRNA靶序列的多核苷酸，其中所述第一miRNA靶序列、所述第二miRNA靶序列和所述第三miRNA靶序列中的每一者由不同的miRNA识别。
7.如权利要求1-5中任一项所述的载体，所述载体包含能被转录以产生相同miRNA靶序列的多核苷酸的至少两个拷贝。
8.如权
9.如权利要求1-4中任一项所述的载体，其中可操作地连接至所述启动子的能被转录以产生miRNA靶序列的每一多核苷酸是相同的。
10.如权利要求1-9中任一项所述的载体，其中能被转录以产生miRNA靶序列的每一多核苷酸位于所述第一多核苷酸的3’。
11.如权利要求10所述的载体，其中所述载体还包含位于所述第一多核苷酸的3’的WPRE序列，并且其中能被转录以产生miRNA靶序列的每一多核苷酸位于所述第一多核苷酸与所述WPRE序列之间。
12.如权利要求1-11中任一项所述的载体，其中从可操作地连接至所述启动子的多核苷酸转录的每一miRNA靶序列独立地被以下之一靶向：miR-183、miR-96、miR-182、miR-18a、miR-100、miR-124a、miR-140、miR-194、miR-135或miR-135b。
13.如权利要求1-12中任一项所述的载体，其中所述第一内耳细胞类型是耳蜗支持细胞，并且所述第二内耳细胞类型是耳蜗毛细胞或螺旋神经节神经元中的至少一者。
14.如权利要求13所述的载体，其中所述第二内耳细胞类型是耳蜗毛细胞。
15.如权利要求1-12中任一项所述的载体，其中所述第一内耳细胞类型是前庭支持细胞，并且所述第二内耳细胞类型是前庭毛细胞或前庭神经节神经元中的至少一者。
16.如权利要求15所述的载体，其中所述第二内耳细胞类型是前庭毛细胞。
17.如权利要求16所述的载体，其中所述第二内耳细胞类型是前庭I型毛细胞。
18.如权利要求1-12中任一项所述的载体，其中所述第一内耳细胞类型是前庭II型毛细胞，并且所述第二内耳细胞类型是前庭I型毛细胞。
19.如权利要求1-12中任一项所述的载体，其中所述第一内耳细胞类型是前庭II型毛细胞，并且所述第二内耳细胞类型是前庭神经节神经元。
20.如权利要求1-12中任一项所述的载体，其中所述多核苷酸编码Atonal BHLH转录因子1(Atoh1)、生长因子独立性1转录阻遏因子(Gfi1)、POU 4类同源盒3(Pou4f3)、IKAROS家族锌指2(Ikzf2)、显性负Sox2(dnSox2)或间隙连接蛋白β2(Gjb2)。
21.如权利要求1-12中任一项所述的载体，其中所述启动子是支持细胞特异性启动子、毛细胞特异性启动子或遍在启动子。
22.如权利要求1-12中任一项所述的载体，其中所述启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子、肌球蛋白15(MYO15)启动子、LFNG O-岩藻糖基肽3-β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(LFNG)启动子、成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)启动子、溶质运载蛋白家族1成员3(SLC1A3)启动子、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子或溶质运载蛋白家族6成员14(SLC6A14)启动子。
23.如权利要求1-22中任一项所述的载体，所述载体还包含能被转录以产生表达产物的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸不同于所述第一多核苷酸。
24.如权利要求23所述的载体，其中所述第二多核苷酸可操作地连接至所述启动子，所述第二多核苷酸位于所述第一多核苷酸的3’，所述至少一个能被转录以产生miRNA靶序列的多核苷酸位于所述第二多核苷酸的3’，并且所述第二多核苷酸适于在所述第一内耳细胞类型中...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种载体，所述载体包含可操作地连接至以下的启动子：
2.如权利要求1所述的载体，其中从所述第一多核苷酸转录的所述表达产物促进所述第一内耳细胞类型向所述第二内耳细胞类型的转化。
3.如权利要求1或2所述的载体，其中所述第一多核苷酸在所述第一内耳细胞类型中表达，但不在所述第二内耳细胞类型中表达。
4.如权利要求1-3中任一项所述的载体，所述载体包含至少两个能被转录以产生mirna靶序列的多核苷酸。
5.如权利要求4所述的载体，所述载体包含能被转录以产生第一mirna靶序列的多核苷酸和能被转录以产生第二mirna靶序列的多核苷酸，其中每一mirna靶序列由不同的mirna识别。
6.如权利要求5所述的载体，所述载体还包含能被转录以产生第三mirna靶序列的多核苷酸，其中所述第一mirna靶序列、所述第二mirna靶序列和所述第三mirna靶序列中的每一者由不同的mirna识别。
7.如权利要求1-5中任一项所述的载体，所述载体包含能被转录以产生相同mirna靶序列的多核苷酸的至少两个拷贝。
8.如权利要求7所述的载体，所述载体包含能被转录以产生相同mirna靶序列的所述多核苷酸的至少三个拷贝。
9.如权利要求1-4中任一项所述的载体，其中可操作地连接至所述启动子的能被转录以产生mirna靶序列的每一多核苷酸是相同的。
10.如权利要求1-9中任一项所述的载体，其中能被转录以产生mirna靶序列的每一多核苷酸位于所述第一多核苷酸的3’。
11.如权利要求10所述的载体，其中所述载体还包含位于所述第一多核苷酸的3’的wpre序列，并且其中能被转录以产生mirna靶序列的每一多核苷酸位于所述第一多核苷酸与所述wpre序列之间。
12.如权利要求1-11中任一项所述的载体，其中从可操作地连接至所述启动子的多核苷酸转录的每一mirna靶序列独立地被以下之一靶向：mir-183、mir-96、mir-182、mir-18a、mir-100、mir-124a、mir-140、mir-194、mir-135或mir-135b。
13.如权利要求1-12中任一项所述的载体，其中所述第一内耳细胞类型是耳蜗支持细胞，并且所述第二内耳细胞类型是耳蜗毛细胞或螺旋神经节神经元中的至少一者。
14.如权利要求13所述的载体，其中所述第二内耳细胞类型是耳蜗毛细胞。
15.如权利要求1-12中任一项所述的载体，其中所述第一内耳细胞类型是前庭支持细胞，并且所述第二内耳细胞类型是前庭毛细胞或前庭神经节神经元中的至少一者。
16.如权利要求15所述的载体，其中所述第二内耳细胞类型是前庭毛细胞。
17.如权利要求16所述的载体，其中所述第二内耳细胞类型是前庭i型毛细胞。
18.如权利要求1-12中任一项所述的载体，其中所述第一内耳细胞类型是前庭ii型毛细胞，并且所述第二内耳细胞类型是前庭i型毛细胞。
19.如权利要求1-12中任一项所述的载体，其中所述第一内耳细胞类型是前庭ii型毛细胞，并且所述第二内耳细胞类型是前庭神经节神经元。
20.如权利要求1-12中任一项所述的载体，其中所述多核苷酸编码atonal bhlh转录因子1(atoh1)、生长因子独立性1转录阻遏因子(gfi1)、pou 4类同源盒3(pou4f3)、ikaros家族锌指2(ikzf2)、显性负sox2(dnsox2)或间隙连接蛋白β2(gjb2)。
21.如权利要求1-12中任一项所述的载体，其中所述启动子是支持细胞特异性启动子、毛细胞特异性启动子或遍在启动子。
22.如权利要求1-12中任一项所述的载体，其中所述启动子是巨细胞病毒(cmv)启动子、肌球蛋白15(myo15)启动子、lfng o-岩藻糖基肽3-β-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶(lfng)启动子、成纤维细胞生长因子受体3(fgfr3)启动子、溶质运载蛋白家族1成员3(slc1a3)启动子、胶质纤维酸性蛋白(gfap)启动子或溶质运载蛋白家族6成员14(slc6a14)启动子。
23.如权利要求1-22中任一项所述的载体，所述载体还包含能被转录以产生表达产物的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸不同于所述第一多核苷酸。
24.如权利要求23所述的载体，其中所述第二多核苷酸可操作地连接至所述启动子，所述第二多核苷酸位于所述第一多核苷酸的3’，所述至少一个能被转录以产生mirna靶序列的多核苷酸位于所述第二多核苷酸的3’，并且所述第二多核苷酸适于在所述第一内耳细胞类型中表达但不在所述第二内耳细胞类型中表达。
25.如权利要求23或24所述的载体，所述载体还包含能被转录以产生表达产物的第三多核苷酸，其中所述第三多核苷酸不同于所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸。
26.如权利要求25所述的载体，其中所述第三多核苷酸可操作地连接至所述启动子，所述第三多核苷酸位于所述第二多核苷酸的3’，所述至少一个能被转录以产生mirna靶序列的多核苷酸位于所述第三多核苷酸的3’，并且所述第三多核苷酸适于在所述第一内耳细胞类型中表达但不在所述第二内耳细胞类型中表达。
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