【技术实现步骤摘要】
本申请涉及类器官培养，具体为一种ecm蛋白-gelma复合水凝胶及将其用于培养神经管类器官的方法。
技术介绍
1、类器官是目前能够高度模拟人类体内器官发生过程的一种新型模型，由多能干细胞或成体干细胞分化产生的器官特异性细胞组成。而且，干细胞在3d环境中能够通过类似于体内的方式进行细胞分选和空间限制性谱系分化，从而自组织为类似体内器官或组织的3d结构。因此，类器官能为发育生物学、药物研发和毒性评价、以及再生医学等领域提供一种介于动物模型和人体临床实验的理想生理模型，具有重要的科学和应用价值。目前，已经有很多方法成功构建了对应不同器官的类器官，包括大脑、视网膜、心脏、肝脏、肾脏、胃、和肠等，以实现在体外研究不同人体器官的功能。与其他类器官相比，神经管类器官的开发相对较晚，在构建更接近体内结构的神经管类器官上还存在一些问题。
2、目前神经管类器官模型的制备严重依赖小鼠肿瘤来源的基质胶(matrigel)，该基质胶生化成分不完全明确，主要是蛋白质的混合物，表现出批次间的可变性，而且其特性不易调节以研究不同参数对类器官的影响，因此，模式化神经管类器官制备的重复性差，并且难以再对该基质胶成分和更新进行调节以提高类器官模式化的效率。再者，该基质胶由engelbreth-holm-swarm小鼠肉瘤细胞产生，可能携带病原体或免疫原，不适合培养用于再生医学的类器官，且该基质胶也存在过度依赖进口，且价格昂贵、价格浮动大的问题。这些问题极大限制了神经管类器官制备的重复性及其在发育机制、神经管畸形模型构建、药物筛选、毒性测试、以及再生医学等
技术实现思路
1、为了解决现有技术中神经管类器官模型的制备严重依赖鼠源的基质胶matrigel的问题，本专利技术提供一种ecm蛋白-gelma复合水凝胶，其成分非常明确，其中有效成分为甲基丙烯酰化明胶、光引发剂和细胞外基质蛋白，该复合水凝胶有潜力替代成分不明确、携带病原体或免疫原且价格更加昂贵的基质胶matirgel应用于再生医学领域。
2、为达到以上目的，本申请采用的技术方案为：一种ecm蛋白-gelma复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
3、s1，将甲基丙烯酰化明胶固体粉末加入磷酸缓冲盐溶液，并在60℃水浴锅中孵育30min混合均匀，得到gelma溶液；
4、s2，缓慢的向所述步骤s1中制备的gelma溶液中加入ecm蛋白溶液，gelma溶液和ecm溶液的体积比为7:3，再加入质量分数为0.25％的光引发剂，并在60℃水浴锅中孵育10min～30min混合均匀，得到复合水凝胶溶液；
5、s3，将所述步骤s2中制备的复合水凝胶溶液趁热过滤，过滤采用0.22μm的无菌膜；
6、s4，将所述步骤s3中过滤后的复合水凝胶溶液用365nm紫外光固化灯照射15s～30s，得到支撑细胞生长的固体复合水凝胶，即水凝胶细胞支架；
7、s5，通过所述步骤s1至所述步骤s4制备出多组所述水凝胶细胞支架，每组所述水凝胶细胞支架中ecm蛋白浓度均不相同，然后对多组所述水凝胶细胞支架进行筛选，筛选出含最适宜的ecm蛋白浓度的所述水凝胶细胞支架。
8、作为上述方案的进一步改进，所述步骤s1中制备的gelma溶液的质量分数的范围为3％～10％。
9、作为上述方案的进一步改进，所述光引发剂为lap光引发剂或光引发剂i2959中的一种。
10、作为上述方案的进一步改进，所述ecm蛋白为胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和玻连蛋白中的一种或多种。
11、作为上述方案的进一步改进，所述步骤s2中制备的复合水凝胶溶液中所述ecm蛋白溶液的浓度范围为60ug/ml～90ug/ml。
12、作为上述方案的进一步改进，所述步骤s1具体为将0.1428g甲基丙烯酰化明胶固体粉末加入2ml的磷酸缓冲盐溶液，并在60℃水浴锅中孵育30min混合均匀，得到质量分数为7.14％的gelma溶液。
13、作为上述方案的进一步改进，所述步骤s2为将质量分数为7.14％的gelma溶液和250ug/ml的ecm蛋白溶液按体积比为7：3混合在60℃水浴锅中孵育20min，得到复合水凝胶溶液。
14、作为上述方案的进一步改进，所述步骤s2中制备的复合水凝胶溶液中所述ecm蛋白溶液的浓度为75ug/ml，所述gelma溶液的质量分数为5％。
15、一种将上述制备的ecm蛋白-gelma复合水凝胶用于培养神经管类器官的方法，包括以下步骤：
16、s101，对人源多能干细胞进行培养：将聚合度达到80％到85％的未分化的胚胎干细胞用edta消化成细胞团块，重悬于1ml的多能干细胞维持培养基(mtesr)中，并以团块接种在基质胶(matrigel)包被的孔板中，再将其置于37℃、质量分数为5％co2、饱和湿度的培养箱中培养；
17、s102，多能干细胞向早期神经管类器官分化：从所述步骤s101中取出一个12孔板的胚胎干细胞，将胚胎干细胞进行细胞消化液(accutase)消化得到细胞沉淀，再用ecm蛋白-gelma复合水凝胶将所述细胞沉淀进行重悬得到水凝胶细胞溶液；用365nm紫外光固化灯照射15秒制备水凝胶细胞支架，转入24孔板，加入含10μm/ml的rock抑制剂的神经诱导培养基培养，并向培养基中加入骨成型蛋白(bmp)和节点(nodal)抑制剂；每天更换新鲜培养基，9天后得到早期的神经管类器官。
18、s103，早期神经管类器官分化为模式化神经管类器官：从分化的第四天开始向神经诱导培养基中，添加浓度可优化的小分子rar核受体激活剂视黄酸(ra)和sonichedgehog信号通路激活剂shh重组蛋白，继续在37℃，5％co2浓度，饱和湿度的培养箱内培养；
19、s104，ecm蛋白种类的筛选：将制备出来的ecm蛋白-gelma复合水凝胶接入人胚胎干细胞培养，并于第1天、第3天观察细胞生长状态，检测细胞存活率，初步确定适合人胚胎干细胞生长的ecm蛋白种类。其次在类器官分化的第9天和第18天分别观察神经管类器官的结构，并检测神经管类器官相关标志物的表达情况以及类器官的结构，以确定适合神经管类器官培养的最佳ecm蛋白种类。
20、进一步地，所述步骤s104中检测细胞存活率通过am/pi染色检验方法进行检测。
21、进一步地，所述步骤s104中检测细胞存活率为90％以上。
22、进一步地，所述步骤s104中检测细胞存活率的具体检验方法如下：使用calcein-am/pi染色，am染色剂通常是无荧光的，能够渗透活细胞膜，被细胞内的酯酶水解为有荧光的物质，发出强烈的绿色荧光。而pi染色剂则是一种红色荧光染料，能够与死细胞中的dna结合，发出红色荧光。通过分析染色后复合水凝胶中细胞呈现红色、绿色荧光的比例，可以判断复合水凝胶的生物相容性好坏。
23、进一步地，对所述步骤s102中所制得的早期神经管类器本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种ECM蛋白-GelMA复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的ECM蛋白-GelMA复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述ECM蛋白为胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和玻连蛋白中的一种或多种。
3.如权利要求2所述的ECM蛋白-GelMA复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中制备的复合水凝胶溶液中所述ECM蛋白溶液的浓度范围为60ug/mL～90ug/mL。
4.如权利要求3所述的ECM蛋白-GelMA复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述光引发剂为LAP光引发剂或光引发剂I2959中的一种。
5.如权利要求4所述的ECM蛋白-GelMA复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S1为将0.1428g甲基丙烯酰化明胶固体粉末加入2ml的磷酸缓冲盐溶液，并在60℃水浴锅中孵育30min混合均匀，得到质量分数为7.14％的GelMA溶液。
6.如权利要求5所述的ECM蛋白-GelMA复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S2为将质量分数为7.14％的GelMA溶液和250u
7.如权利要求6所述的ECM蛋白-GelMA复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中制备的复合水凝胶溶液中所述ECM蛋白溶液的浓度为75ug/mL，所述GelMA溶液的质量分数为5％。
8.一种将如权利要求1-7中任一项制备的ECM蛋白-GelMA复合水凝胶用于培养神经管类器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.如权利要求8所述的培养神经管类器官的方法，其特征在于，所述步骤S104中检测细胞存活率通过AM/PI染色检验方法进行检测；所述步骤S104中检测细胞存活率为90％以上。
10.如权利要求9所述的培养神经管类器官的方法，其特征在于，对所述步骤S102中制得的早期神经管类器官进行检测，可同时采用以下两种方法，方法一：使用RT-qPCR检测，得到所述步骤S102制得的类器官为PAX6+/NESTIN+/SOX2+，其中，PAX6，NESTIN，SOX2为神经上皮细胞的指标；方法二为：使用免疫荧光检测类器官中的细胞表型及类器官的形态，得到早期神经管类器官中的细胞是PAX6+/NESTIN+/SOX2+的，并且类器官是含一个中央腔的三维结构，N-CADHERIN和ZO-1的腔侧表达显示出类器官顶端-基底极性的形成，其中，N-CADHERIN是在神经板和神经管形成期间表达的最早的神经外胚层标志物；在神经管形成过程中，紧密连接蛋白ZO-1移位并聚集于官腔侧；
...【技术特征摘要】
1.一种ecm蛋白-gelma复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的ecm蛋白-gelma复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述ecm蛋白为胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和玻连蛋白中的一种或多种。
3.如权利要求2所述的ecm蛋白-gelma复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中制备的复合水凝胶溶液中所述ecm蛋白溶液的浓度范围为60ug/ml～90ug/ml。
4.如权利要求3所述的ecm蛋白-gelma复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述光引发剂为lap光引发剂或光引发剂i2959中的一种。
5.如权利要求4所述的ecm蛋白-gelma复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤s1为将0.1428g甲基丙烯酰化明胶固体粉末加入2ml的磷酸缓冲盐溶液，并在60℃水浴锅中孵育30min混合均匀，得到质量分数为7.14％的gelma溶液。
6.如权利要求5所述的ecm蛋白-gelma复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤s2为将质量分数为7.14％的gelma溶液和250ug/ml的ecm蛋白溶液按体积比为7：3混合在60℃水浴锅中孵育20min，得到复合水凝胶溶液。
7.如权利要求6所述的ecm蛋白-gelma复合水凝胶的制...
【专利技术属性】
技术研发人员：聂海峰，郑媛媛，李新玉，张方荣，荀家莉，吴李君，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：
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