【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，具体涉及一种微量dna电化学提取方法。
技术介绍
1、循环肿瘤dna（circulating tumor dna，ctdna）主要由原发性肿瘤，循环肿瘤细胞，微小或明显转移到癌症患者血液中的dna片段组成，ctdna大部分来源于肿瘤细胞的凋亡和坏死。mandelp于1948年首次在正常人外周血发现游离dna（cfdna）。1977年，leon sa等再次发现肿瘤患者血浆cfdna含量显著高于健康人，且晚期肿瘤患者的cfdna水平更高，除了在血浆中发现cfdna，在肿瘤患者的尿液、组织液和淋巴液中，也发现少量的cfdna。随后有研究表明ctdna携带肿瘤特异性遗传改变，包括突变，拷贝数变异，同时发现ctdna还携带有癌症组织特异的表观遗传改变，肿瘤组织的特异性甲基化模式与ctdna高度相关。因此通过对ctdna的生物学特性检测可以达到微创快速的筛查癌症并能对癌症进行实时纵向监测。
2、通过ctdna进行肿瘤检测可以采用外周血和尿液进行，其中，采用尿液进行属于无创检测，是一种最理想的检测手段，然而，外周血和尿液中的ctdna含量甚微，采用普通提取方法无法满足提取量和纯度的要求。现有的检测手段如pcr可以采用微量dna量进行，但是其对纯度的要求也较高。尿液中的ctdna含量极其稀少，如何将其提取出来并用于pcr检测的合格样品，是本领域急需解决的一个技术问题。
3、专利cn 110257371 a公开了一种人血浆中提取游离dna的方法，该方法采用电化学的方法，提取到纯度较高的cfdna，
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种微量dna电化学提取方法。
2、一种微量dna电化学提取方法，按照如下步骤进行：
3、（1）制备导电水凝胶预凝液：将丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、n,n-亚甲基双丙烯酰胺、脱乙酰几丁质、单（6-氨基-6-去氧）-β-环糊精和去离子水加入到容器中混合，搅拌混匀5～10min，加入过硫酸铵，搅拌混匀5～10min，最后加入四甲基乙二胺混匀，制成导电水凝胶预凝液；
4、（2）制备复合电极：将戊二醛水溶液滴到玻碳电极上反应，得到交联后的玻碳电极，将步骤（1）制备的导电水凝胶预凝液滴到交联后的玻碳电极表面反应，得到复合电极；玻碳电极在反应前进行预处理：抛光打磨玻碳电极，超纯水冲洗，分别在丙酮、乙醇、超纯水中超声3min，超声后每次都用超纯水清洗，最后氮气吹干，得到预处理后的玻碳电极；
5、（3）收集样品，将样品进行前处理，得到样品处理液；
6、（4）将步骤（2）制备的复合电极浸入步骤（3）得到的样品处理液中，搅拌后，采用电化学工作站，对工作电极施加恒定电刺激以捕获dna，得到吸附dna后的凝胶修饰电极；
7、（5）将步骤（4）吸附dna后的凝胶修饰电极取出，浸入tris溶液中，施加与步骤（4）相反的恒定电刺激以释放凝胶修饰电极中捕获的dna，得到提取的dna产物。
8、步骤（1）所述丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、n,n-亚甲基双丙烯酰胺、脱乙酰几丁质、单（6-氨基-6-去氧)-β-环糊精和去离子水的用量质量比为：（20～60）：（10～30）：（20～40）：（3～8）：（20～30）：1000。
9、步骤（1）所述过硫酸铵的用量占去离子水质量的0.1%～0.2%。
10、步骤（1）所述四甲基乙二胺的用量占去离子水质量的0.05%～0.15%。
11、步骤（2）所述反应的温度为35℃～40℃，反应时间20min～80min。
12、步骤（3）所述样品为人血液样品，获取样品后离心，取上层血浆。
13、步骤（3）所述样品为人尿液样品，获取样品后离心，取上层液体后超速离心，弃去上层80%液体后采用tris溶液稀释。
14、步骤（5）所述tris溶液的浓度为8 mmol/l～15mmol/l，ph值为7.0～8.0。
15、步骤（4）所述恒定电刺激为4 v～6v，150 s～200s。
16、步骤（5）所述恒定电刺激为-5 v～-3v，50 s～70s。
17、本专利技术的有益效果：本专利技术的dna电化学提取方法可以提取人血液、组织液和尿液中微量的游离dna，用于pcr检测的样品。本专利技术的导电水凝胶采用甲叉双丙烯酰胺、n,n-亚甲基双丙烯酰胺的组合，在通正电时使得游离dna能部分浸入水凝胶中，在通负电时能快速解离；脱乙酰几丁质、单（6-氨基-6-去氧）-β-环糊精组合使用，能将带负电的蛋白、尿素等抑制pcr的抑制物截留，使得提取的dna能更好的进行pcr。
18、甲叉双丙烯酰胺、n,n-亚甲基双丙烯酰胺与丙烯酰胺制备的凝胶与n,n-亚甲基双丙烯酰胺与丙烯酰胺制备的凝胶及甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺制备的凝胶相比，具有更大的网状结构，因此能够吸附容纳更多的cfdna 分子，提高提取量；脱乙酰几丁质在凝胶体系内具有较高的强度，单（6-氨基-6-去氧）-β-环糊精（cas no:29390-67-8）也能维系较高的强度，使得吸附cfdna的网状孔道比较坚固，cfdna 分子在反向电离时，较为顺利，可以在短时间内脱除干净，此外单（6-氨基-6-去氧）-β-环糊精为优良的吸附剂，可以吸附一些小分子的pcr抑制剂，其侧翼基团更加增强了这种功能。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种微量DNA电化学提取方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
2.根据权利要求1所述微量DNA电化学提取方法，其特征在于，步骤（1）所述丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、脱乙酰几丁质、单（6-氨基-6-去氧)-β-环糊精和去离子水的用量质量比为：（20～60）：（10～30）：（20～40）：（3～8）：（20～30）：1000。
3.根据权利要求1所述微量DNA电化学提取方法，其特征在于，步骤（1）所述过硫酸铵的用量占去离子水质量的0.1%～0.2%。
4.根据权利要求1所述微量DNA电化学提取方法，其特征在于，步骤（1）所述四甲基乙二胺的用量占去离子水质量的0.05%～0.15%。
5.根据权利要求1所述微量DNA电化学提取方法，其特征在于，步骤（2）所述反应的温度为35%～40℃，反应时间20min～80min。
6.根据权利要求1所述微量DNA电化学提取方法，其特征在于，步骤（3）所述样品为人血液样品，获取样品后离心，取上层血浆。
7.根据权利要求1所述微量DNA电化学提取方法，
8.根据权利要求1所述微量DNA电化学提取方法，其特征在于，步骤（5）所述Tris溶液的浓度为8 mmol/L～15mmol/L，pH值为7.0～8.0。
9.根据权利要求1所述微量DNA电化学提取方法，其特征在于，步骤（4）所述恒定电刺激为4 V～6V，150 s～200s。
10.根据权利要求1所述微量DNA电化学提取方法，其特征在于，步骤（5）所述恒定电刺激为-5 V～-3V，50 s～70s。
...【技术特征摘要】
1.一种微量dna电化学提取方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
2.根据权利要求1所述微量dna电化学提取方法，其特征在于，步骤（1）所述丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、n,n-亚甲基双丙烯酰胺、脱乙酰几丁质、单（6-氨基-6-去氧)-β-环糊精和去离子水的用量质量比为：（20～60）：（10～30）：（20～40）：（3～8）：（20～30）：1000。
3.根据权利要求1所述微量dna电化学提取方法，其特征在于，步骤（1）所述过硫酸铵的用量占去离子水质量的0.1%～0.2%。
4.根据权利要求1所述微量dna电化学提取方法，其特征在于，步骤（1）所述四甲基乙二胺的用量占去离子水质量的0.05%～0.15%。
5.根据权利要求1所述微量dna电化学提取方法，其特征在于，步骤（2）所述反应的温度为35%～40℃，反应时间20m...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱柳，韩达，张玉想，师学江，
申请(专利权)人：北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。