本发明专利技术涉及化妆品功效评价技术领域，具体涉及一种基于斑马鱼模型的乌发化妆品功效评价方法，包括以下步骤：S1.设置正常对照组、模型对照组、阳性药物组和样品药物组，所述各组均包括相同数量的斑马鱼胚胎；S2.分别向上述各组中加入对应的药品和样品进行培养；S3.对培养完的各组斑马鱼胚胎分别进行酪氨酸酶活性、黑色素含量、黑色素面积及灰度和Tyrosinase基因定量检测，根据检测结果计算得出功效评价。本发明专利技术解决了现有乌发化妆品功效评价中存在动物试验成本高、周期长的技术问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及化妆品功效评价，具体涉及一种基于斑马鱼模型的乌发化妆品功效评价方法。
技术介绍
1、国家化妆品法规规定，功效化妆品需要通过实验验证其宣称的功效才能获批上市。而对于功能化妆品的功效评价，现有技术中主要有以下几种方式：1.体外检测酪氨酸酶抑制作用；2.dpph/orac/abts/frap抗氧化测试；3.羟自由基检测；4.小鼠黑色素细胞抑制实验；5.人黑色素细胞抑制实验；6.抑制人黑色素转移实验。
2、上述方法存在以下缺陷：
3、1.体外检测缺乏吸收、分布、代谢和排泄的过程，无法准确预测改善色素代谢障碍的供试品在人体是否真正有效，也无法预测在体内代谢后代谢产物具有改善色素代谢障碍功效的供试品；
4、2.体外检测不具备可视化的优势，展现形式不直观，不利于化妆品和保健食品的宣传推广；
5、3.可用于替代实验的色素代谢障碍动物模型尚未建立；
6、4.人体实验周期较长，不利于大批量的供试品功效评价，尤其不适用于早期的配方筛选。
技术实现思路
1、本专利技术意在提供一种基于斑马鱼模型的乌发化妆品功效评价方法，以解决现有乌发化妆品开发筛选功效评价中存在动物试验成本高、周期长的技术问题。
2、为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种基于斑马鱼模型的乌发化妆品功效评价方法,包括以下步骤：
3、s1.设置正常对照组、模型对照组、阳性药物组和样品药物组，所述各组均包括相同数量的斑马鱼胚胎；
>4、s2.分别向上述各组中加入对应的药品和样品进行培养；5、s3.对培养完的各组斑马鱼胚胎分别进行酪氨酸酶活性、黑色素含量、黑色素面积及灰度和tyrosinase基因定量检测，根据检测结果计算得出功效评价。
6、本方案的原理及优点是：
7、本方案中选用斑马鱼作为实验模型，斑马鱼与人类基因同源性高达85％，其信号传导通路与人类基本近似，生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似，且受精后5天(5dpf)内的斑马鱼幼鱼不需要进食，不属于动物，被欧盟认为在伦理学方面是可以接受，因此相比于其他动物模型更适合用于化妆品功效和安全性评价的替代实验。并且相比于其他动物模型，斑马鱼还具有个体小、发育周期短、实验周期短、费用低、可直接观察药物对内部器官的作用以及实验用药量小等优点，作为模式生物的优势很突出。
8、其中针对乌发化妆品的功效检测，本申请专利技术人从酪氨酸酶活性检测、黑色素含量检测、黑色素面积检测、黑色素灰度检测和tyrosinase基因定量pcr检测5个方面进行综合评价，建立了完整的评价体系，能够从多维度、全面的评价乌发化妆品的功效，提高了评价的准确性。
9、优选的，作为一种改进，所述各组中斑马鱼胚胎数量为50～60条，所述斑马鱼胚胎为24hpf～72hpf。选用一定数量的斑马鱼胚胎以保证实验结果的精确性，发育至24hpf～72hpf的斑马鱼胚胎更适合作为实验模型。
10、优选的，作为一种改进，所述正常对照组中使用清水培养，所述模型对照组中加入模型药培养，所述阳性药物组先加入模型药物培养，后再加入阳性药物培养。阳性药物组中需要加入的模型药物作为完整对比实验组。
11、优选的，作为一种改进，所述样品药物组包括高浓度样品组、中浓度样品组和低浓度样品组。
12、优选的，作为一种改进，所述高浓度样品组中样品浓度为100～150μg/ml；所述中浓度样品组中样品浓度为33.3～50μg/ml；所述低浓度样品组中样品浓度为11.1～16.7μg/ml。设置多浓度样品组能够更全面的反应样品的功效范围，可以得出样品的有效作用范围。
13、优选的，作为一种改进，所述s3中酪氨酸酶活性检测方法为：向培养好的各组斑马鱼胚胎中加入蛋白裂解液，超声破碎后向其中加入l-dopa孵育，孵育完成后检测。使用蛋白裂解液结合超声破碎的方法，能够保证斑马鱼胚胎裂解完全，保证其中活性物质充分暴露。
14、优选的，作为一种改进，所述超声破碎的时间为10～15min，脉冲强度为40％～45％，循环间隔为10s～15s。超声时间或强度不足，会导致斑马鱼胚胎细胞裂解不完全，酪氨酸酶的释放量不足，导致后续与l-dopa反应的酪氨酸酶不足。如果超声时间过久，会导致释放出的酪氨酸酶在试管中的活性降低，降低后续酶与底物的反应效率，造成假阴性结果。
15、优选的，作为一种改进，所述s3中黑色素含量检测方法为：向培养好的各组斑马鱼胚胎中加入蛋白裂解液，超声破碎后离心收集沉淀，再向沉淀中加入氢氧化钠，加热重悬后冷却稀释检测。使用蛋白裂解液结合超声破碎的方法，能够保证斑马鱼胚胎裂解完全，保证其中活性物质充分暴露。
16、优选的，作为一种改进，所述s3中黑色素面积及灰度检测方法为：使用凝胶将培养好的各组斑马鱼固定，采集背部照片，使用image j图像分析软件对所采集照片的黑色区域面积和灰度值进行选定和计算。
17、优选的，作为一种改进，所述s3中tyrosinase基因定量检测方法为：向培养好的各组斑马鱼胚胎中加入rnaiso plus和氯仿充分裂解后离心，吸取上清液并向其中加入等体积的异丙醇，混合重悬后离心取沉淀，洗涤沉淀后溶解；溶解后先进行反转录再进行定量pcr检测。
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【技术保护点】
1.一种基于斑马鱼模型的乌发化妆品功效评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于斑马鱼模型的乌发化妆品功效评价方法，其特征在于：作为一种改进，所述各组中斑马鱼胚胎数量为50～60条，所述斑马鱼胚胎为24hpf～72hpf。
3.根据权利要求2所述的一种基于斑马鱼模型的乌发化妆品功效评价方法，其特征在于：S1中正常对照组中使用清水培养，所述模型对照组中加入模型药培养，所述阳性药物组先加入模型药物培养，后再加入阳性药物培养。
4.根据权利要求3所述的一种基于斑马鱼模型的乌发化妆品功效评价方法，其特征在于：S1中样品药物组包括高浓度样品组、中浓度样品组和低浓度样品组。
5.根据权利要求4所述的一种基于斑马鱼模型的乌发化妆品功效评价方法，其特征在于：所述高浓度样品组中样品浓度为100～150μg/mL；所述中浓度样品组中样品浓度为33.3～50μg/mL；所述低浓度样品组中样品浓度为11.1～16.7μg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种基于斑马鱼模型的乌发化妆品功效评价方法，其特征在于：S3中酪氨酸酶活性检测方法为：向培养好的各组斑马鱼胚胎中加入蛋白裂解液，超声破碎后向其中加入L-dopa孵育，孵育完成后检测。
7.根据权利要求1所述的一种基于斑马鱼模型的乌发化妆品功效评价方法，其特征在于：S3中黑色素含量检测方法为：向培养好的各组斑马鱼胚胎中加入蛋白裂解液，超声破碎后离心收集沉淀，再向沉淀中加入氢氧化钠，加热重悬后冷却稀释检测。
8.根据权利要求6或7中所述的一种基于斑马鱼模型的乌发化妆品功效评价方法，其特征在于：所述超声破碎的时间为10～15min，脉冲强度为40％～45％，循环间隔为10s～15s。
9.根据权利要求1所述的一种基于斑马鱼模型的乌发化妆品功效评价方法，其特征在于：S3中黑色素面积及灰度检测方法为：使用凝胶将培养好的各组斑马鱼固定，采集背部照片，使用image J图像分析软件对所采集照片的黑色区域面积和灰度值进行选定和计算。
10.根据权利要求1所述的一种基于斑马鱼模型的乌发化妆品功效评价方法，其特征在于：S3中Tyrosinase基因定量检测方法为：向培养好的各组斑马鱼胚胎中加入RNAiso Plus
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【技术特征摘要】
1.一种基于斑马鱼模型的乌发化妆品功效评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于斑马鱼模型的乌发化妆品功效评价方法，其特征在于：作为一种改进，所述各组中斑马鱼胚胎数量为50～60条，所述斑马鱼胚胎为24hpf～72hpf。
3.根据权利要求2所述的一种基于斑马鱼模型的乌发化妆品功效评价方法，其特征在于：s1中正常对照组中使用清水培养，所述模型对照组中加入模型药培养，所述阳性药物组先加入模型药物培养，后再加入阳性药物培养。
4.根据权利要求3所述的一种基于斑马鱼模型的乌发化妆品功效评价方法，其特征在于：s1中样品药物组包括高浓度样品组、中浓度样品组和低浓度样品组。
5.根据权利要求4所述的一种基于斑马鱼模型的乌发化妆品功效评价方法，其特征在于：所述高浓度样品组中样品浓度为100～150μg/ml；所述中浓度样品组中样品浓度为33.3～50μg/ml；所述低浓度样品组中样品浓度为11.1～16.7μg/ml。
6.根据权利要求1所述的一种基于斑马鱼模型的乌发化妆品功效评价方法，其特征在于：s3中酪...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭兰，张涛，范能全，陈裔，黄宇，范英杰，
申请(专利权)人：重庆医药高等专科学校，
类型：发明
国别省市：
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