【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物传感，涉及含glai对5-gmcgmc甲基化位点的识别并切割，及其触发expar等温扩增联合cas酶识别剪切体系的荧光传感平台及其在dna甲基化检测中的应用。
技术介绍
1、哺乳动物dnacpg二核苷酸上胞嘧啶甲基化(5-mc)是最常见和最重要的表观遗传修饰，在基因表达调控、基因组印迹和x染色体失活中起着关键作用。异常的cpg甲基化状态，特别是发生在基因启动子区域cpg岛的甲基化状态异常，可能导致基因沉默，进而促进肿瘤的发生和发展。因此，异常的dna甲基化可作为肿瘤早期诊断、肿瘤发生和预后评估的重要生物标志物。cldn11是claudin家族成员，对维持细胞极性和组织连接有着重要作用。有研究发现，与癌旁组织相比，cldn11在非小细胞肺癌中表达下调；此外，cldn11的表达受dna甲基化调控，并与远处转移相关，cldn11甲基化可能作为nsclc的诊断以及预后的分子标志物。多项研究表明，在黑色素瘤、膀胱癌、胃癌和鼻咽癌和中发现cldn11高度甲基化，并与多种癌症的侵袭相关。因此，准确、灵敏地检测特定位点dna甲基化可为临床诊断和预后提供可靠信息。
2、检测dna甲基化的方法通常有两类，即亚硫酸氢盐转化辅助法或基于甲基化敏感限制性内切酶消化法。亚硫酸氢盐基因组测序技术是临床检测dna甲基化的金标准。在亚硫酸氢盐处理下，未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持完整，进一步的测序可以分析dna的胞嘧啶甲基化。该方法可以检测全基因组中甲基化胞嘧啶，但过程繁琐、耗时，且可能由于甲基化dna降解和未甲
3、血清中特定位点的甲基化片段浓度很低，必须偶联高效扩增过程来可靠地检测人血清中甲基化dna。pcr是临床试验中最常用的扩增方法。然而，pcr过程复杂、设备要求高，且试剂昂贵，还通常由于非特异性扩增而存在的假阳性。近年来，越来越多的扩增方法用于检测甲基化dna，包括连接酶链反应(lcr)、链置换扩增(sda)、滚环扩增(rca)和指数扩增反应(expar)。lcr具有较高的灵敏度和特异性，但也需要精确控制的热循环。sda和rca可以在恒温条件下检测dna甲基化，但需要较长的反应时间和复杂的模板设计。而expar扩增效率高(106～109)(<30min)，模板设计灵活。有研究表明，glai裂解的甲基化dna末端片段可以有效触发expar，而未甲基化的dna不会发生expar扩增。然而expar的非特异性扩增限制其广泛应用。据报道，expar的非特异性扩增主要产生于扩增后期，若适时终止expar扩增，其产物用于后续扩增及级联信号放大，可能有效避免expar的非特异性扩增。另一方面，詹妮弗研究于2018年发现，cas12a结合的导向rna与dna靶标的结合可以激活cas12a高效反式切割单链dna报告基因，这为高灵敏、特异性和便捷的dna检测提供了有用工具。借助glai对cpg岛上5-gmcgmc甲基化位点的裂解，触发expar扩增产生大量单链dna再激活cas12a级联信号放大，可实现特异且灵敏的甲基化dna检测。
技术实现思路
1、本专利技术构建了5’-mcg位点甲基化依赖剪切酶glai启动的expar联合cas12a检测dna甲基化平台。glai能特异性的识别并切割dna的5’-gmcgmc-3’甲基化位点并产生具有游离3’-oh末端的dna片段，以启动expar，在短时间内扩增大量的单链dna，而未甲基化的dna不能被切割，无法启动后续反应；积累的单链dna激活crispr/cas12a的反式切割活性，以产生数千倍效率放大的荧光信号。应用该平台，只要改变expar模板的3’端序列就能检测到不同的靶点。该策略不但适用于多种癌组织中dna特异位点甲基化检测，也适用于血清样本中微量甲基化dna尤其是体液中游离的甲基化短链dna，为游离甲基化dna提供一个快速、简单、通用检测体系。
2、1.一种甲基化依赖酶切触发的dna特异位点甲基化快速检测方法，其包括如下特征系统和步骤：1)甲基化依赖的限制性内切酶glai特异性识别5’-gmcgmc-3’特征序列并切割5’-mcg位点，同时产生具有3’-oh末端的dna片段为目标序列片段；2)以目标序列片段为引物，启动以所述模板的expar指数扩增反应，在短时间内扩增产生大量单链dna；3)累积的单链dna靶向crispr/cas12a上引导rna同步激活crispr/cas12a的反式切割活性，以数千倍效率放大荧光信号；在如优选条件下，其荧光变化速率与目标甲基化dna片段呈剂量关系。
3、2.所述一种甲基化依赖酶切触发的dna特异位点甲基化快速检测方法，其所需expar模板的序列特征可选x引导的x-n-x，x-x-n-y，x-y-n-y，x-n-y-n-y，优选x-y-n-y模板以实现通用性和高效性；x序列与glai切割处理产生的目标序列片段互补，随所选目标序列改变而改变；n为可被nt.bstnbi内切酶识别并切割的小序列，由识别序列5’-gagtc-3’且在3’端加上任意四个碱基构成；所述模板中的y序列可选与x不完全相同的任一序列，不随目标序列改变而改变，仅需与所述crispr/cas12a的引导rna互补配对；应用所述优选模板x-y-n-y实现expar指数扩增，可快速产生y序列的互补单链dna。
4、3.所述一种甲基化依赖酶切触发的dna特异位点甲基化快速检测方法，其所需crispr/cas12a系统以如下特征序列为引导rna，引导rna可变区含有如所述y序列，能识别经expar产生的大量y序列的互补单链并有效激活crispr/cas12a，反式切割荧光报告探针。
5、4.所述优选expar模板及对应crispr/cas12a的引导rna可变区包括但不限于如下特征序列：
6、expar不同模板的优选序列(x为glai切割后目标序列片段的互补序列)：
7、1)5’-aactatacaacctactacctcaaacagactcaactatacaacctactacctcaaaca-x-p-3’
8、2)5’-aactataca本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种甲基化依赖酶切触发的DNA特异位点甲基化快速检测方法，其包括如下特征系统和步骤：1)甲基化依赖的限制性内切酶GlaI特异性识别5’-GmCGmC-3’特征序列并切割5’-mCG位点，同时产生具有3’-OH末端的DNA片段为目标序列片段；2)以目标序列片段为引物，启动以模板的EXPAR指数扩增反应，在短时间内扩增产生大量单链DNA；3)累积的单链DNA靶向CRISPR/Cas12a上引导RNA同步激活CRISPR/Cas12a的反式切割活性，以数千倍效率放大荧光信号；在如优选条件下，其荧光变化速率与目标甲基化DNA片段呈剂量关系。
2.如权利要求1所述一种甲基化依赖酶切触发的DNA特异位点甲基化快速检测方法，其所需EXPAR模板的序列特征可选X引导的X-N-X，X-X-N-Y，X-Y-N-Y，X-N-Y-N-Y，优选X-Y-N-Y模板以实现通用性和高效性；X序列与GlaI切割处理产生的目标序列片段互补，随所选目标序列改变而改变；N为可被Nt.BstNBI内切酶识别并切割的小序列，由识别序列5’-GAGTC-3’且在3’端加上任意四个碱基构成；所述模板中的Y序列可
3.如权利要求1所述一种甲基化依赖酶切触发的DNA特异位点甲基化快速检测方法，其所需CRISPR/Cas12a系统以如下特征序列为引导RNA，引导RNA可变区含有如权利要求2所述Y序列，能识别经EXPAR产生的大量Y序列的互补单链并有效激活CRISPR/Cas12a，反式切割荧光报告探针。
4.如权利要求2和3所述优选EXPAR模板及对应CRISPR/Cas12a的引导RNA可变区包括但不限于如下特征序列：
5.如权利要求1所述一种甲基化依赖酶切触发的DNA特异位点甲基化快速检测方法，其针对甲基化CLDN11基因经GlaI切割后任一特异目标序列片段，可选相应互补序列X；特别地，针对CLDN11基因特异的4309位点甲基化经GlaI切割后片段，互补序列X优选为：GCCCGCTCGTCCCTATCCAACCC。
6.如权利要求3所述CRISPR/Cas12a系统所需荧光报告探针，其报告探针核酸链可选含连续4-8个C碱基的DNA链，报告探针核酸链还可是富含T-A的5-10个碱基的DNA链，优选6个C碱基的DNA链；
7.如权利要求1-6所述一种甲基化依赖酶切触发的DNA特异位点甲基化快速检测方法，各组分特征配方和优选条件如下：
8.如权利要求1-7所述一种甲基化依赖酶切触发的DNA特异位点甲基化快速检测方法，改变权利要求4中EXPAR模板中X序列，可检测不同甲基化序列片段，具有通用性。
9.如权利要求1-8所述一种甲基化依赖酶切触发的DNA特异位点甲基化快速检测方法，适用于循环DNA甲基化片段快速检测，具有突出优势。
10.如权利要求1-8所述一种甲基化依赖酶切触发的DNA特异位点甲基化快速检测方法，样本来源包括但不限于组织样本、血清样本、尿液提取核酸样本；按常规试剂盒方法裂解并提取或直接提取所得DNA样品、血清或尿液稀释后的样品。
...【技术特征摘要】
1.一种甲基化依赖酶切触发的dna特异位点甲基化快速检测方法，其包括如下特征系统和步骤：1)甲基化依赖的限制性内切酶glai特异性识别5’-gmcgmc-3’特征序列并切割5’-mcg位点，同时产生具有3’-oh末端的dna片段为目标序列片段；2)以目标序列片段为引物，启动以模板的expar指数扩增反应，在短时间内扩增产生大量单链dna；3)累积的单链dna靶向crispr/cas12a上引导rna同步激活crispr/cas12a的反式切割活性，以数千倍效率放大荧光信号；在如优选条件下，其荧光变化速率与目标甲基化dna片段呈剂量关系。
2.如权利要求1所述一种甲基化依赖酶切触发的dna特异位点甲基化快速检测方法，其所需expar模板的序列特征可选x引导的x-n-x，x-x-n-y，x-y-n-y，x-n-y-n-y，优选x-y-n-y模板以实现通用性和高效性；x序列与glai切割处理产生的目标序列片段互补，随所选目标序列改变而改变；n为可被nt.bstnbi内切酶识别并切割的小序列，由识别序列5’-gagtc-3’且在3’端加上任意四个碱基构成；所述模板中的y序列可选与x不完全相同的任一序列，不随目标序列改变而改变，仅需与所述crispr/cas12a的引导rna互补配对；应用所述优选模板x-y-n-y实现expar指数扩增，可快速产生y序列的互补单链dna。
3.如权利要求1所述一种甲基化依赖酶切触发的dna特异位点甲基化快速检测方法，其所需crispr/cas12a系统以如下特征序列为引导rna，引导rna可变区含有如权利要求2所述y序列，能识别经expar产生的大量y...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓兰，吴巧敏，
申请(专利权)人：重庆医科大学国际体外诊断研究院，
类型：发明
国别省市：
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