【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种分子组合生物标志物及其检测试剂盒。
技术介绍
1、多囊卵巢综合征(pcos)是一种最常见的内分泌和代谢紊乱的异质性疾病，在多个方面影响女性健康，pcos在育龄女性中的患病率为5％～18％。pcos患者通常伴有各种症状，包括高雄激素血症、胰岛素抵抗、高血压、超重、ii型糖尿病等。当前pcos诊断的标准多采用鹿特丹标准，符合高雄激素血症、稀发排卵或无排卵、彩超显示多囊卵巢三项中的两项，同时也会结合患者的性激素和其他临床症状进行综合评估。据统计，70％被诊断为多囊症的女性在未来几年内会不孕，鉴于pcos的复杂性和特异性，临床上对其具体的发病原因及发病的机制尚缺乏明确的结论。当前正缺乏用于快速诊断pcos的生物标志物，主要原因是没有发现一种专门针对pcos的特异性志物。
2、表观遗传学主要的特点是在dna序列保持不变的情况下，基因功能或活性发生可遗传和可逆的变化。其中，dna甲基化是表观遗传学中研究最广泛、理解最透彻的之一，涉及许多疾病，包括癌症、印迹基因和重复不稳定性疾病。研究人员在pcos患者的卵巢组织、脂肪组织、外周血和颗粒细胞中观察到一些基因改变了dna甲基化，如prdm1、pparg、kctd21和lhcgr。同时，在pcos患者的卵巢和血液中发现了大量差异甲基化的cpg位点，这些位点被认为与免疫和炎症密切相关。因此，可能在pcos患者中的某种卵巢细胞中，存在一部分基因特定的dna甲基化，用于维持pcos疾病的发生发展。传统诊断中，除了鉴定患者高雄激素血症、稀发排卵或无排卵、彩超多囊
3、如何有效筛选出专门针对pcos诊断的特异性标志物，成为了科研人员亟需解决的科学问题。因此，研发出快速、准确用于诊断pcos疾病的试剂盒，为以卵巢疾病为代表的生殖系统疾病的诊断提供新的思路。
4、因此，本领域的技术人员致力于开发一种特异性联合生物标志物，并研发快速、准确该联合生物标志物的试剂盒。
技术实现思路
1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是如何开发一种特异性分子组合生物标志物，并研发快速、准确该分子组合生物标志物的试剂盒。
2、为实现上述目的本专利技术提供了一种分子组合生物标志物的筛选方法，包括以下步骤：
3、步骤1、构建pcos的小鼠模型；
4、步骤2、从步骤1获得的小鼠模型提取基因组dna和总rna，
5、步骤3、对步骤3提取的基因组dna和总rna分别进行dna甲基化测序、转录组测序、mirna测序；
6、步骤4、将步骤3得到的dna甲基化组测序数据、转录组测序数据、mirna测序数据与pcos患者临床样品中的测序数据联合分析，筛选出具有相同变化趋势的差异表达基因和差异甲基化基因，即启动子区低甲基化高表达的基因；
7、步骤5、将步骤4筛选出的启动子区低甲基化高表达的基因进行甲基化特异性pcr验证和rt-qpcr验证，得到表达与甲基化呈现负相关的基因为anxa1基因。
8、进一步地，步骤3还包括：
9、步骤3.1、从步骤2获得的基因组dna富集全基因组甲基化片段；
10、步骤3.2、使用步骤4获得的全基因组甲基化片段构建全基因组甲基化文库。
11、进一步地，步骤3.1利用与生物素偶联的人mbd2蛋白实现甲基化片段的富集。
12、进一步地，步骤1还包括：对icr小鼠注射二氢睾酮。
13、本申请还提供了一种检测分子组合生物标志物的试剂盒，包括反转录部分和扩增特定甲基化区域部分。
14、本申请还提供了一种分子组合检测生物标志物的试剂盒的应用方法，将提取的基因组dna进行亚硫酸氢盐转化，总rna反转录为cdna，将cdna再进行qpcr，并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶水平作为内参基因，利用rt-qpcr检测anxa1基因、ldlr基因和has-mir-106a-5p的表达水平，甲基化特异性的pcr检测anxa1基因启动子区的甲基化水平。
15、进一步地，rt-qpcr的引物为anxa1-f和anxa1-r，所述anxa1-f的核苷酸序列如seqid no.1所示，所述anxa1-r的核苷酸序列如seq id no.2所示。
16、进一步地，使用甲基化试剂盒对提取后片段化的基因组dna进行富集，富集后的片段进行dna甲基化测序文库的构建。
17、进一步地，分别添加针对anxa1启动子区未甲基化和甲基化的专用引物进行甲基化特异性的pcr扩增，扩增的产物在进行2％的琼脂糖凝胶电泳。
18、进一步地，扩增的产物的核苷酸序列如seq id no.3所示。
19、进一步地，通过检测患者颗粒细胞ldlr的负调控mirna和表达水平、anxa1基因启动子甲基化和表达水平，达到快速、准确、高效诊断pcos。
20、进一步地，通过对icr小鼠注射二氢睾酮(dht)作为体外研究的pcos模型，并对构建的pcos小鼠模型进行了血清和形态学的鉴定，取下小鼠卵巢组织，提取了基因组dna，进行dna甲基化测序。同时，对pcos患者的颗粒细胞提取了基因组dna和总rna，分别进行了dna甲基化测序、转录组测序、mirna测序。筛选pcos诊断标志物的过程中，结合动物模型和临床样品测序数据，将dna甲基化组学、转录组学、mirna测序数据进行联合分析，筛选出在动物模型和临床样品中具有相同趋势的差异表达基因。
21、在本专利技术的较佳实施方式1中，详细说明构建pcos小鼠模型的过程；
22、在本专利技术的另一较佳实施方式2中，详细说明提取核酸的过程；
23、在本专利技术的另一较佳实施方式3中，详细说明mbd蛋白富集全基因组甲基化片段的过程；
24、在本专利技术的另一较佳实施方式4中，详细说明构建mbd蛋白富集全基因组甲基化文库的过程；
25、在本专利技术的另一较佳实施方式5中，详细说明构建转录组测序(rna-seq)文库的过程；
26、在本专利技术的另一较佳实施方式6中，详细说明构建转录组测序(rna-seq)文库的过程；
27、在本专利技术的另一较佳实施方式7中，详细说明检测anxa1基因、ldlr基因和has-mir-106a-5p的试剂盒的应用过程。
28、本专利技术有益的技术效果如下：
29、本专利技术构建了pcos的小鼠模型，方便后续对pcos的进一步研究。
30、将pcos小鼠模型和临床样品甲基化测序联合，鉴定出在模型和临床样品中均特异的差异甲基化基因。利用高量测序技术，将甲基化组学和转录组学联合，筛选出表达与甲基化呈现负相关的基因，将其作为pcos诊断标志物。
31、本专利技术提供了pcos小鼠模型的构建方法，和一种新的pcos诊断标志物的筛选技术。所鉴定出的anxa1基因在本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分子组合生物标志物的筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3还包括：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3.1利用与生物素偶联的人MBD2蛋白实现甲基化片段的富集。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1还包括：对ICR小鼠注射二氢睾酮。
5.一种检测分子组合生物标志物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括反转录部分和扩增特定甲基化区域部分，所述联合生物标志物为ANXA1基因、LDLR基因和has-miR-106a-5p。
6.如权利要求5所述的试剂盒的应用方法，其特征在于，将提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化，总RNA反转录为cDNA，将所述cDNA再进行qPCR，并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶水平作为内参基因，利用RT-qPCR检测所述ANXA1基因、所述LDLR基因和所述has-miR-106a-5p的表达水平，甲基化特异性的PCR检测所述ANXA1基因启动子区的甲基化水平。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所
8.一种如权利要求5所述的试剂盒的应用方法，其特征在于，使用甲基化试剂盒对提取后片段化的基因组DNA进行富集，富集后的片段进行DNA甲基化测序文库的构建。
9.如权利要求8所述的试剂盒的应用方法，其特征在于，分别添加针对ANXA1启动子区未甲基化和甲基化的专用引物进行甲基化特异性的PCR扩增，扩增的产物在进行2％的琼脂糖凝胶电泳。
10.如权利要求9所述的试剂盒的应用方法，其特征在于，所述扩增的产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
...【技术特征摘要】
1.一种分子组合生物标志物的筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3还包括：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3.1利用与生物素偶联的人mbd2蛋白实现甲基化片段的富集。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1还包括：对icr小鼠注射二氢睾酮。
5.一种检测分子组合生物标志物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括反转录部分和扩增特定甲基化区域部分，所述联合生物标志物为anxa1基因、ldlr基因和has-mir-106a-5p。
6.如权利要求5所述的试剂盒的应用方法，其特征在于，将提取的基因组dna进行亚硫酸氢盐转化，总rna反转录为cdna，将所述cdna再进行qpcr，并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶水平作为内参基因，利用rt-qpcr检测所述anxa1基因、所述ldlr基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：康亚妮，张飞，黄立师，丁奕岑，何梦菊，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
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