【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种酶突变体及其在合成氯吡格雷中的应用，具体为一种酰化酶突变体及其在合成(s)-邻氯苯甘氨酸以及(s)-氯吡格雷中的应用。
技术介绍
1、氯吡格雷(clopidogrel,(s)-α-(2-氯苯基)-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-5(4h)-乙酸甲酯，methyl(+)-(s)-α-(o-chlorophenyl)-6,7-dihydrothieno[3,2-c]pyridine-5(4h)-acetate))是于1986年首先研制得到的一种抗血小板凝聚药物，它被广泛应用于不稳定性的心绞痛、心肌梗塞、中风等血栓性疾病的临床治疗。目前氯吡格雷是最受欢迎的p2y12受体(一种驱动血小板活化的g蛋白偶联受体)拮抗剂，与传统的抗血小板药物阿司匹林、噻氯吡啶相比，氯吡格雷作用强度和耐受性大大增强，且副作用并没有明显增大，成为目前抗血小板凝聚的主流药物之一。
2、目前氯吡格雷的合成方法主要是通过不对称合成技术实现的，其中主要以(s)-邻氯苯甘氨酸或(r)-邻氯扁桃酸为主要的手性合成底物。(s)-邻氯苯甘氨酸传统的化学合成法是对d-樟脑磺酸和l-酒石酸进行化学拆分。但化学拆分法选择性差，得到的是s型和r型的混合物，从而加大分离纯化的成本，进而影响终产物氯吡格雷的光学纯度。近年来，生物催化拆分制备(s)-邻氯苯甘氨酸成为主流的研究方向，但目前相关研究都有各自的不足，如立体选择性不足、产物得率低或生产成本高等一系列问题。
3、酰化酶对含苯环的酰基侧链有高度立体选择性，能够特异性地
技术实现思路
1、针对现有技术中酰化酶活性不高的问题，本专利技术对来自于priestia megaterium的酰化酶进行了分子改造以提高其酶活，通过高通量筛选方法得到用于催化合成(s)-氯吡格雷中间体(s)-邻氯苯甘氨酸的高活性酰化酶突变体，解决了现有技术中因酰化酶酶活较差而导致(s)-邻氯苯甘氨酸合成产量不理想的问题。
2、本专利技术采用的技术方案是：一种酰化酶突变体，所述酰化酶突变体是对巨大普里斯特氏菌(priestia megaterium)来源的酰化酶的氨基酸序列的第224位、第339位、第467位、第474位、第494位、第518位进行单突变或多点联合突变获得的。所述巨大普里斯特氏菌(priestia megaterium)来源的酰化酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。本专利技术通过大分子建模技术对priestia megaterium来源的酰化酶pmpga的三维结构进行模拟，利用能量最低原理和分子对接技术，经蛋白结构自由能计算预测出可能与催化相关的一个或多个氨基酸位点，通过定点突变来降低蛋白整体结构的自由能来增加蛋白稳定性。在确定突变的位点以及突变的氨基酸种类后，以碱基序列如seq id no.1所示的野生型酰化酶pmpga为模板，采用定点突变引物进行pcr扩增，分别将突变产物通过载体转化至宿主菌中，经培养筛选出具有突变基因的阳性克隆。随后从阳性克隆中提取载体dna进行序列测定分析，以确定引入的突变。最后将筛选得到的突变产物转入宿主菌中诱导表达，从中筛选出活性显著提高的突变体，即所述的酰化酶突变体。
3、作为优选，所述酰化酶突变体是对seq id no.2所示的氨基酸序列进行了以下位点的单突变或多点联合突变获得的：
4、(7)第224位谷氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸、天冬氨酸中的一种；
5、(8)第339位缬氨酸突变为丙氨酸或天冬氨酸；
6、(9)第467位缬氨酸突变为天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸中的一种；
7、(10)第474位谷氨酸突变为脯氨酸或缬氨酸；
8、(11)第494位谷氨酸突变为甲硫氨酸；
9、(12)第518位缬氨酸突变为脯氨酸或丙氨酸。
10、作为优选，所述酰化酶突变体是对氨基酸序列如seq id no.2所示的酰化酶第224位谷氨酸突变为亮氨酸、第339位缬氨酸突变为天冬氨酸、第467位缬氨酸突变为丝氨酸获得的。
11、作为优选，所述酰化酶突变体是对氨基酸序列如seq id no.2所示的酰化酶第224位谷氨酸突变为亮氨酸、第467位缬氨酸突变为天冬氨酸、第494位谷氨酸突变为甲硫氨酸获得的。
12、作为优选，所述酰化酶突变体是对氨基酸序列如seq id no.2所示的酰化酶第224位谷氨酸突变为亮氨酸、第339位缬氨酸突变为天冬氨酸、第467位缬氨酸突变为丝氨酸、第494位谷氨酸突变为甲硫氨酸获得的。
13、本专利技术还提供了上述任一酰化酶突变体的编码基因。作为优选，所述酰化酶突变体是在碱基序列如seq id no.1所示的野生型酰化酶pmpga的基础上，将编码第224位谷氨酸的密码子突变成编码亮氨酸的密码子，将编码第339位缬氨酸的密码子突变成编码天冬氨酸的密码子，将编码第467位缬氨酸的密码子突变成编码丝氨酸的密码子，将编码第494位谷氨酸的密码子突变成编码甲硫氨酸的密码子而得到的。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。
14、本专利技术还提供了含有上述酰化酶突变体编码基因的重组载体。所述重组载体包含与适合指导在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的多核苷酸。所述重组载体的骨架结构可以为各种表达载体，包括但不限于pet表达载体、pcw表达载体、puc表达载体或ppic9k表达载体中的任意一种表达载体。优选以质粒pet-28a(+)为表达载体，并将所述的酰化酶突变体编码基因克隆至所述的质粒pet-28a构成重组载体。
15、本专利技术还提供了含有上述酰化酶突变体编码基因的基因工程菌。所述基因工程菌是将上述的酰化酶突变体的编码基因连接到表达载体得到重组载体，然后将重组载体转化到宿主菌，即得到基因工程菌。所述宿主菌可以为本领域的各种常规宿主载体，包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌或毕赤酵母，优选大肠杆菌escherichia coli bl21(de3)作为宿主菌。
16、本专利技术还提供了上述的酰化酶突变体，或上述酰化酶突变体编码基因的重组载体，或含有上述酰化酶突变体编码基因的基因工程菌在催化合成(s)-邻氯苯甘氨酸中的应用，所述应用包括：以含酰化酶突变体编码基因的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体破碎后提取的酶液为催化剂，以n-苯乙酰-(r,s)-邻氯苯甘氨酸为底物，以缓冲液为反应介质，构成反应体系，反应获得(s)-邻氯苯甘氨酸。可以理解的是，当涉及本专利技术的酰化酶突变体的应用时，有多种可行的形式选择。这包括以下几种形式：基因工程菌全细胞形式使用，未经纯化的粗酶形式使用，部分本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酰化酶突变体，其特征在于，所述酰化酶突变体是对巨大普里斯特氏菌(Priestia megaterium)来源的酰化酶的氨基酸序列的第224位、第339位、第467位、第474位、第494位、第518位进行单突变或多点联合突变获得的，所述巨大普里斯特氏菌(Priestia megaterium)来源的酰化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的酰化酶突变体，其特征在于，所述酰化酶突变体是对SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列进行了以下位点的单突变或多点联合突变获得的：
3.如权利要求1所述的酰化酶突变体，其特征在于，所述酰化酶突变体是对如SEQ IDNO.2所示的酰化酶的氨基酸序列的第224位谷氨酸突变为亮氨酸、第339位缬氨酸突变为天冬氨酸、第467位缬氨酸突变为丝氨酸、第494位谷氨酸突变为甲硫氨酸获得的。
4.编码权利要求1、2、3任一所述的酰化酶突变体的基因。
5.含有权利要求4所述酰化酶突变体编码基因的重组载体。
6.含有权利要求4所述酰化酶突变体编码基因的基因工程菌。
...【技术特征摘要】
1.一种酰化酶突变体，其特征在于，所述酰化酶突变体是对巨大普里斯特氏菌(priestia megaterium)来源的酰化酶的氨基酸序列的第224位、第339位、第467位、第474位、第494位、第518位进行单突变或多点联合突变获得的，所述巨大普里斯特氏菌(priestia megaterium)来源的酰化酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.如权利要求1所述的酰化酶突变体，其特征在于，所述酰化酶突变体是对seq idno.2所示的氨基酸序列进行了以下位点的单突变或多点联合突变获得的：
3.如权利要求1所述的酰化酶突变体，其特征在于，所述酰化酶突变体是对如seq idno.2所示的酰化酶的氨基酸序列的第224位谷氨酸突变为亮氨酸、第339位缬氨酸突变为天冬氨酸、第467位缬氨酸突变为丝氨酸、第494位谷氨酸突变为甲硫氨酸获得的。
4.编码权利要求1、2、3任一所述的酰化酶突变体的基因。
5.含有权利要求4所述酰化酶突变体编码基因的重组载体。
6.含有权利要求4所述酰化...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚平，沈其，颜剑波，成碟，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江乐普药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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