【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种用于骨软骨一体化修复的微凝胶组装双层支架及其制备方法。
技术介绍
1、由于原生骨软骨组织的高度复杂性和特殊生物学特性，重建骨软骨组织界面的复杂微观结构仍然是一个具有挑战性的问题。目前，骨软骨组织工程的研究主要集中在生物仿生支架的设计上。组织工程支架的传统制造策略是采用“自上而下”的方法，即将细胞接种到可生物降解的三维仿生支架上，如海绵、纤维和水凝胶。在生长因子或生化线索的帮助下，使得填充到支架内的细胞产生适当的细胞外基质。然而，采用“自上而下”策略设计的支架往往难以再现骨软骨组织界面复杂的微观结构特征。因此，设计一种能模拟骨软骨组织不同生化特性的支架至关重要。
2、最近采用的“自下而上”模块化组装的方法提供了通过改善组织和细胞外基质形成来重建天然组织复杂微结构的替代策略。该策略是将微观尺度的较小模块组装成一个更大的宏观结构，与同质的大块结构相比，提供了对分层组织成分和结构的更强控制。微凝胶是一种新兴的组织工程应用材料，是构建宏观结构尺寸支架的良好模块化组件，在骨软骨组织工程中具有很大的应用潜力。
3、骨髓间充质干细胞是一种多能干细胞，可在适当的生物、化学和物理信号作用下分化为软骨细胞或成骨细胞。然而，普通水凝胶支架引导细胞双向分化的能力有限，缺乏修复骨软骨组织所需的固有物理结构和性能，不能很好地模拟生物环境，不足以替代有缺陷的骨软骨组织。
4、目前，许多研究致力于利用多种生长因子改善骨软骨组织工程支架，以增强对骨髓间充质干细胞的双向分化诱导效果。这些生长
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种用于骨软骨一体化修复的微凝胶组装双层支架及其制备方法。该双层支架利用碳碳双键和苯硼酸双改性的透明质酸作为组装交联剂，通过“自下而上”的策略实现改性明胶/生物活性玻璃复合微凝胶和改性明胶/硫酸软骨素复合微凝胶的空间组装。其具有开放的多孔结构和良好的细胞相容性，能够促进骨髓间充质干细胞成软骨和成骨双向分化，可以用于骨软骨组织缺损的一体化再生修复。
2、本专利技术的目的通过以下技术方案之一实现。
3、一种用于骨软骨一体化修复的微凝胶组装双层支架的制备方法，包括以下步骤：
4、(1)在缓冲溶液中，加入光引发剂、碳碳双键和多巴胺双改性明胶和生物活性玻璃，得改性明胶/生物活性玻璃悬浮水溶液；在缓冲溶液中，加入光引发剂、碳碳双键和多巴胺双改性明胶和硫酸软骨素，得改性明胶/硫酸软骨素复合水溶液；
5、(2)将所述改性明胶/生物活性玻璃悬浮水溶液和改性明胶/硫酸软骨素复合水溶液分别加入到含有司盘80的液体石蜡中，搅拌形成改性明胶/生物活性玻璃液滴、改性明胶/硫酸软骨素液滴，再将所得液滴在紫外光照下引发自由基聚合实现微凝胶的内部交联，然后经洗涤和过滤得到改性明胶/生物活性玻璃复合微凝胶、改性明胶/硫酸软骨素复合微凝胶；
6、(3)将所述改性明胶/生物活性玻璃复合微凝胶悬浮于含有光引发剂的碳碳双键和苯硼酸双改性透明质酸溶液中，并装入注射器a中；将改性明胶/硫酸软骨素复合微凝胶悬浮于含有光引发剂的碳碳双键和苯硼酸双改性透明质酸溶液中，并装入注射器b中；
7、(4)利用注射器将两种微凝胶悬液依次注射到模具中，在紫外光照下，原位构建微凝胶组装双层支架。
8、优选的，步骤(1)中所述硫酸软骨素来源于牛软骨，分子量为10～20kda，在缓冲溶液中的质量浓度为10mg/ml～60mg/ml，进一步优选为40mg/ml；所述生物活性玻璃的粒径为10～200nm，在缓冲溶液中的质量浓度为10mg/ml～50mg/ml。
9、优选的，步骤(2)中所获得的微凝胶直径尺寸为100μm～400μm。
10、优选的，步骤(3)中所使用透明质酸的分子量为1000kda～1500kda；碳碳双键和苯硼酸双改性透明质酸在缓冲溶液中的质量浓度为5mg/ml～30mg/ml。
11、优选的，步骤(3)中所述改性明胶/生物活性玻璃复合微凝胶悬浮在含有光引发剂的碳碳双键和苯硼酸双改性透明质酸溶液中的质量浓度为50mg/ml～200mg/ml；所述改性明胶/硫酸软骨素复合微凝胶悬浮在含有光引发剂的碳碳双键和苯硼酸双改性透明质酸溶液中的质量浓度为50mg/ml～200mg/ml。
12、优选的，步骤(4)中所述注射器将两种微凝胶悬液依次注射到模具，是先用注射器a注射改性明胶/生物活性玻璃复合微凝胶悬浮液后，再用注射器b注射改性明胶/硫酸软骨素复合微凝胶悬浮液。
13、优选的，步骤(1)、步骤(3)中所述光引发剂为光引发剂i 2959，在缓冲溶液中的质量浓度为5mg/ml；步骤(1)中所述碳碳双键和多巴胺双改性明胶在缓冲溶液中的质量浓度为200mg/ml；步骤(2)中所述复合水溶液或悬浮水溶液与液体石蜡的体积比为1:15；所述司盘80和液体石蜡的体积比为1:30。
14、优选的，步骤(2)中紫外光照射时间为10min，步骤(4)中紫外光照射时间为1min～5min。
15、优选的，步骤(2)中搅拌速度为300rpm；所述搅拌时间为30min。
16、优选的，步骤(2)中所述洗涤微凝胶采用的有机溶剂，可选为石油醚或丙酮。
17、优选的，
18、步骤(1)所述碳碳双键和多巴胺双改性明胶的制备包括以下步骤：
19、将明胶溶解在磷酸盐缓冲溶液中，逐滴加入甲基丙烯酸酐，反应3h～5h后，用5倍磷酸盐缓冲溶液终止反应并搅拌均匀，将反应物透析后冻干，得到碳碳双键改性的明胶；再将碳碳双键改性的明胶溶解于吗啉乙磺酸缓冲液，再加入羧酸活化剂活化羧基；在氮气氛围下，加入盐酸多巴胺，避光反应24h，将反应物透析后冻干，得到碳碳双键和多巴胺双改性明胶；所述明胶来源于猪皮(gel strength～240g bloom)；
20、步骤(3)所述碳碳双键和苯硼酸双改性透明质酸的制备包括以下步骤：
21、将透明质酸溶解于吗啉乙磺酸缓冲液中，加入3-氨基苯硼酸，避光反应24h后，将反应物透析后冻干，得到苯硼酸改性透明质酸；再将苯硼酸改性透明质酸溶解于去离子水中，逐滴加入甲基丙烯酸酐，调节ph值为8～9，反应12h后将反应物透析后冻干，得到碳碳双键和苯硼酸双改性透明质酸；
22、由以上任一项所述的制备方法制得的一种用于骨软骨一体化修复的微凝胶组装双层支架。
23、本专利技术根据骨软骨组织不同生理特性，将硫酸软骨素和生物活性玻璃引入双层支架，以特异性引导细胞双向分化，实现骨软骨组织界面复杂的微观结构特征。
24、与传统的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于骨软骨一体化修复的微凝胶组装双层支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于骨软骨一体化修复的微凝胶组装双层支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述硫酸软骨素来源于牛软骨，分子量为10～20KDa，在缓冲溶液中的质量浓度为10mg/mL～60mg/mL；所述生物活性玻璃的粒径为10～200nm，在缓冲溶液中的质量浓度为10mg/mL～50mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种用于骨软骨一体化修复的微凝胶组装双层支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所获得的微凝胶直径尺寸为100μm～400μm。
4.根据权利要求1所述的一种用于骨软骨一体化修复的微凝胶组装双层支架的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所使用透明质酸的分子量为1000KDa～1500KDa；碳碳双键和苯硼酸双改性透明质酸在缓冲溶液中的质量浓度为5mg/mL～3mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种用于骨软骨一体化修复的微凝胶组装双层支架的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述改性明胶/生物活性玻璃复合微凝胶悬浮在
6.根据权利要求1所述的一种用于骨软骨一体化修复的微凝胶组装双层支架的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述注射器将两种微凝胶悬液依次注射到模具，是先用注射器A注射改性明胶/生物活性玻璃复合微凝胶悬浮液后，再用注射器B注射改性明胶/硫酸软骨素复合微凝胶悬浮液。
7.根据权利要求1所述的一种用于骨软骨一体化修复的微凝胶组装双层支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)、步骤(3)中所述光引发剂为光引发剂I 2959，在缓冲溶液中的质量浓度为5mg/mL；步骤(1)中所述碳碳双键和多巴胺双改性明胶在缓冲溶液中的质量浓度为200mg/mL；步骤(2)中所述复合水溶液或悬浮水溶液与液体石蜡的体积比为1:15；所述司盘80和液体石蜡的体积比为1:30。
8.根据权利要求1所述的一种用于骨软骨一体化修复的微凝胶组装双层支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)中紫外光照射时间为10min，步骤(4)中紫外光照射时间为1min～5min。
9.根据权利要求1所述的一种用于骨软骨一体化修复的微凝胶组装双层支架的制备方法，其特征在于，
10.由权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的一种用于骨软骨一体化修复的微凝胶组装双层支架。
...【技术特征摘要】
1.一种用于骨软骨一体化修复的微凝胶组装双层支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于骨软骨一体化修复的微凝胶组装双层支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述硫酸软骨素来源于牛软骨，分子量为10～20kda，在缓冲溶液中的质量浓度为10mg/ml～60mg/ml；所述生物活性玻璃的粒径为10～200nm，在缓冲溶液中的质量浓度为10mg/ml～50mg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种用于骨软骨一体化修复的微凝胶组装双层支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所获得的微凝胶直径尺寸为100μm～400μm。
4.根据权利要求1所述的一种用于骨软骨一体化修复的微凝胶组装双层支架的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所使用透明质酸的分子量为1000kda～1500kda；碳碳双键和苯硼酸双改性透明质酸在缓冲溶液中的质量浓度为5mg/ml～3mg/ml。
5.根据权利要求1所述的一种用于骨软骨一体化修复的微凝胶组装双层支架的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述改性明胶/生物活性玻璃复合微凝胶悬浮在含有光引发剂的碳碳双键和苯硼酸双改性透明质酸溶液中的质量浓度为50mg/ml～200mg/ml；所述改性明胶/硫酸软骨素复合微凝胶悬浮在含有光引发剂的碳碳双键和...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘卅，王燕焱，任力，严茹玉，杨海，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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