【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及用于靶核酸片段特异性指数级扩增的试剂盒及其应用。
技术介绍
1、核酸分子体外扩增技术是开展分子生物学研究的基础。随着生物技术的发展,建立一套灵敏、快速和高特异性的核酸扩增技术一直是研究工作者探讨的问题。在聚合酶链式反应(pcr)以其灵敏性和特异性而广泛应用的基础上，新的核酸扩增模式也不断涌现。现有核酸扩增技术根据其特点可分为两类：第一类是靶核酸的直接扩增，另一类是信号放大扩增。根据是否需要温度循环也可分为两类：一类是非等温扩增，另一类是等温扩增体系。
2、目前本专业研究工作者熟知的扩增技术有：pcr、lamp、rpa等。这些技术各有自己的优缺点，如pcr扩增技术灵敏度高、特异性好，且检测时间越来越短，但仍然需要昂贵的专业设备进行扩增与检测。而lamp扩增技术与rpa扩增技术则是在等温扩增技术种类中，产业转化应用率最高，表现较为优异的技术。其中lamp扩增技术最大的特点是可以兼顾灵敏度、特异性和检测速度的同时，实现一种无需专业设备的简易检测，但lamp引物的设计难度远高于pcr和rpa等扩增技术，且对设计引物的靶标核酸序列长度有比较高的要求。而rpa扩增技术主要以其超高的灵敏度，超快的检测速度著称，但高灵敏度之下必然很难保证其扩增的特异性，也是困扰本专业研究工作者的一个难题。
技术实现思路
1、本专利技术旨在专利技术一种不逊于pcr扩增的高灵敏度、不逊于lamp扩增的高特异性与检测速度，且引物设计较为简单，同样能实现等温扩增的一种新型核酸扩增技
2、本专利技术的目的之一在于提供一种用于靶核酸片段扩增的试剂盒。
3、本专利技术提供了一种用于靶核酸片段扩增的试剂盒，包括正向gdna、反向gdna、正向扩增引物、反向扩增引物、tth argonaute核酸内切酶和聚合酶，
4、所述正向gdna和所述反向gdna特异性结合于靶核酸片段的相对链，且两者3’端指向彼此，能够指导所述tth argonaute核酸内切酶切割包含所述靶核酸片段的核酸分子，所述正向gdna和所述反向gdna不能完全互补；
5、正向扩增引物的序列含有与所述正向gdna相同的序列，反向扩增引物的序列含有与所述反向gdna相同的序列，所述正向扩增引物和反向扩增引物能够在所述聚合酶作用下扩增所述靶核酸片段。
6、正向gdna和反向gdna均为单链dna且5’端磷酸化。
7、正向gdna和反向gdna长度可为16～18nt。
8、正向扩增引物的序列5’端至少含有与所述正向gdna5’端相同的10nt碱基，例如10～18nt，具体可为10、12、14、16或18nt。
9、反向扩增引物的序列5’端至少含有与所述反向gdna5’端相同的10nt碱基，例如10～18nt，具体可为10、12、14、16或18nt。
10、该试剂盒利用tth argonaute核酸内切酶、聚合酶与特殊设计的扩增引物，实现对不同靶标底物的高温等温特异性指数级扩增，并且扩增得到的产物可以用于多个方面的检测分析应用。
11、tth argonaute核酸内切酶，是一种可编辑的核酸内切酶，其通过在5’端磷酸化的gdna指导下，可发挥dna介导的核酸内切酶作用，并在与gdna向导链第10和11个碱基互补的位置激活切割，切割后的底物生成新的5’/3’末端。本专利技术基于上述原理，分别设计两个识别不同区段的5’磷酸化的gdna序列，指导核酸内切酶对底物或产物(即包含靶核酸片段的核酸分子)进行切割。
12、上述试剂盒主要工作原理为，包含靶核酸片段的核酸分子首先在正向gdna指导的tth argonaute核酸内切酶的作用下被切割，获得具有粘性末端的核酸分子(包含靶核酸片段的核酸分子为双链)或者单链核酸分子(包含靶核酸片段的核酸分子为单链)，正向扩增引物含有与所述正向gdna相同的序列，与粘性末端或单链核酸分子匹配，具有粘性末端的核酸分子或者单链核酸分子和正向扩增引物并在聚合酶的作用下向5’端延伸；待延伸到特定切割位点时，被反向gdna指导的tth argonaute核酸内切酶切割，获得具有粘性末端的核酸分子或者单链核酸分子，反向扩增引物含有与所述反向gdna相同的序列，与粘性末端或者单链核酸分子匹配，具有粘性末端的核酸分子或者单链核酸分子和反向扩增引物结合并在聚合酶的作用下向5’端延伸；延伸回到正向gdna指导的tth argonaute核酸内切酶的切割位点，并被正向gdna指导的tth argonaute核酸内切酶再次切割。往复如此，从而实现核酸序列特异性的靶标切割等温指数扩增。
13、可选地，根据上述的试剂盒，所述正向扩增引物序列和/或所述反向扩增引物序列的5’端还包括barcode序列。
14、可选地，根据上述的试剂盒，所述正向扩增引物序列和/或所述反向扩增引物序列的3’端还包括能够特异性结合于靶核酸片段的序列，以便在所述聚合酶的作用下向所述靶核酸片段5’端延伸。
15、具体地，正向扩增引物与反向扩增引物可由三个区段组成，从3’端至5’端依次为：第一区段能够特异性结合于靶核酸片段的序列，以便在所述聚合酶的作用下向所述靶核酸片段5’端延伸；第二区段含有与所述正向gdna或所述反向gdna相同的序列，一方面用于固定扩增引物与核酸分子的结合，另一方面在相对扩增引物在聚合酶的作用下延伸时，将序列补齐，从再次激活gdna引导的tth argonaute核酸内切酶活性，实现循环切割；第三区段为barcode序列。
16、可选地，根据上述的试剂盒，还包括atp、kcl、mgcl2、dntps、tris-hcl(ph＝8.0)和/或dna结合染料。
17、可选地，根据上述的试剂盒，所述正向gdna特异性结合于靶核酸片段的结合区域和所述反向gdna特异性结合于靶核酸片段的结合区域不重叠。
18、所述聚合酶可为bst dna聚合酶。
19、上述的试剂盒的应用也属于本专利技术的保护范围之内。所述应用可为在如下任一中的应用：
20、(1)靶核酸片段扩增；
21、(2)靶核酸片段等温扩增；
22、(3)靶核酸片段检测；
23、(4)测序；
24、(5)制备靶核酸片段扩增产品；
25、(6)制备靶核酸片段等温扩增产品；
26、(7)制备靶核酸片段检测产品；
27、(8)制备测序产品。
28、本专利技术还提供了靶核酸片段的扩增方法，包括
29、(1)将上述正向gdna和上述反向gdna混合获得预混物，再将所述预混物、atp和tthargonaute核酸内切酶混合孵育获得正向/反向gdna-tth argonaute核酸内切酶复合物；
30、(2)混本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于靶核酸片段扩增的试剂盒，其特征在于：包括正向gDNA、反向gDNA、正向扩增引物、反向扩增引物、Tth argonaute核酸内切酶和聚合酶，
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：
4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于：所述正向gDNA特异性结合于靶核酸片段的结合区域和所述反向gDNA特异性结合于靶核酸片段的结合区域不重叠。
5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于：所述聚合酶为Bst DNA聚合酶。
6.权利要求1-5任一所述的试剂盒在如下任一中的应用：
7.靶核酸片段的扩增方法，其特征在于：包括
8.靶核酸片段的检测方法，其特征在于：包括
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述DNA结合染料选自EvaGreen和/或SYBRGreen。
10.根据权利要求7所述的扩增方法或权利要求8所述的检测方法，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.用于靶核酸片段扩增的试剂盒，其特征在于：包括正向gdna、反向gdna、正向扩增引物、反向扩增引物、tth argonaute核酸内切酶和聚合酶，
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：
4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于：所述正向gdna特异性结合于靶核酸片段的结合区域和所述反向gdna特异性结合于靶核酸片段的结合区域不重叠。
5.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈燕旌，张岩，边素莹，张诚，董镇赫，李光辉，周志雄，
申请(专利权)人：首都体育学院，
类型：发明
国别省市：
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