【技术实现步骤摘要】
：本专利技术属于生物化工领域，具体涉及一种双功能ppnk固定化酶及其在辅酶ii生产工艺中的应用。
技术介绍
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技术介绍
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1、氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(简称：辅酶ⅱ，英文名：nicotinamideadenine dinucleotide phosphate，nadp)是一种极为重要的核苷酸类辅酶。它是烟酸酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)与一个磷酸分子以酯键结合的物质，参与多种合成代谢反应，如脂类、脂肪酸和核苷酸的合成。辅酶ⅱ在生物体内除了作为氢转移的载体，还作为磷酸转移的媒介参与各种合成反应。因此，辅酶ii在酶催化不对称合成、医疗健康、食品领域具有广泛的应用。
2、辅酶ii一般通过辅酶i在多聚磷酸依赖型nad激酶(简称ppnk酶)的作用下与六偏磷酸钠反应生成，再通过脱盐和冻干等后处理步骤得到。但是在现有生产技术中主要存在反应过程中产物抑制的问题，
3、由于产物抑制，所以只能在低底物浓度下进行催化反应，且反应时间长，生产效率极低。另外，产物抑制也会导致大量的底物辅酶i的残留，反应时间长也产生大量的降解杂质，导致分离和纯化比较困难，得到的产品质量差；由于底物无法反应完全，需要回收套用，使该工艺只能使用间歇式反应器生产，无法实现连续管道化生产。
4、因此，我们需要寻找一种工业上能够解决生产效率低、产品质量差和无法实现连续化的问题。
技术实现思路
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技术实现思路
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1、本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种操
2、一方面，本专利技术提供了一种双功能ppnk固定化酶。
3、本专利技术提供的双功能ppnk固定化酶是在具备催化功能的同时，保留载体结构中的疏水性基团(环氧基)，具备一定的选择性疏水吸附功能，从而达到降低底物流速，增加底物保留反应时间的目的。
4、本专利技术提供的双功能ppnk固定化酶的制备方程式如下：
5、①载体活化
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7、②ppnk酶的固定化
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9、③ppnk酶的稳定化
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11、其中，表示氨基环氧载体；表示ppnk酶。
12、本专利技术采用的制备双功能ppnk固定化酶的具体技术方案如下：选择氨基环氧载体，加入戊二醛进行活化，制备醛基环氧树脂；然后用醛基环氧树脂对酶进行固定化，形成席夫碱形式的固定化衍生物；最后用硼氢化钠对席夫碱形式的固定化衍生物进行还原，得到稳定的双功能固定化酶。
13、进一步，所述氨基环氧载体选自氨基环氧琼脂糖或氨基环氧树脂，优选氨基环氧树脂。
14、更进一步，所述氨基环氧琼脂糖选自ae琼脂糖或bcl琼脂糖。
15、更进一步，所述氨基环氧树脂选自sepabeads ec hfa、lxte-707，优选lxte-707。
16、进一步，所述戊二醛浓度选自0.1％～25％，优选1％～5％。
17、进一步，反应需要控制磷酸缓冲液ph值，ph值选自6.0～8.0，优选6.5～7.5。
18、更进一步，所述磷酸缓冲液浓度选自0.01～0.05m，优选0.01～0.03m。
19、另一方面，本专利技术提供一种使用双功能ppnk固定化酶催化制备辅酶ii的生产工艺。
20、本专利技术提供的辅酶ii的生产工艺制备方程式如下：
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22、本专利技术采用的双功能ppnk固定化酶催化制备辅酶ii的生产工艺具体技术方案如下：先将ppnk固定化酶装入带有保温装置和定量进料系统的固定床催化反应器中，将含有辅酶i和六偏磷酸钠的反应溶液按一定的流速打入固定床催化反应器中，辅酶i在固定化载体的疏水吸附作用下被吸附，增加底物保留时间，同时在固定化ppnk酶的作用下与六偏磷酸钠反应生成辅酶ii。由于辅酶ii极性增大，从疏水载体上解吸，准备收集瓶，从反应器出料端接收高纯度的辅酶ii水溶液。
23、进一步，所述辅酶i的浓度为1～200g/l，优选80～120g/l。
24、进一步，所述六偏磷酸钠浓度为0.2～100g/l，优选20～30g/l。
25、进一步，所述反应ph值为6.0～8.0，优选6.5～7.5。
26、进一步，所述反应温度选自-20～50℃，优选20～40℃。
27、进一步，所述反应液流速选自0.1～10bv/h，优选0.2～1bv/h。
28、本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过制备具有催化和降低底物流速的双功能ppnk固定化酶，再将其填充在管式固定床反应器中对底物辅酶i进行催化反应得到辅酶ii，解决了生产生产效率低、产品质量差和无法实现连续化的问题。
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1.一种双功能Ppnk固定化酶的制备方法，其特征在于，先选择氨基环氧载体，加入戊二醛活化制得醛基环氧树脂，然后对Ppnk酶进行固定化，形成席夫碱形式的固定化衍生物，最后用硼氢化钠还原得到双功能Ppnk固定化酶。
2.一种如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氨基环氧载体选自氨基环氧琼脂糖或氨基环氧树脂。
3.一种如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述氨基环氧树脂选自LXTE-707、SEPABEADS EC HFA。
4.一种如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述戊二醛浓度选自1％～5％。
5.一种如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应需要控制pH值，pH值选自6.5～7.5。
6.一种使用双功能Ppnk固定化酶制备辅酶II的生产工艺，其特征在于，将含有辅酶I和六偏磷酸钠的反应溶液按一定的流速打入装有双功能Ppnk固定化酶的固定床催化反应器中，反应生成辅酶II。
7.如权利要求6所述的生产工艺，其特征在于，所述辅酶I的浓度为1～200g/L。
8.如权利要求6所述的生产
9.如权利要求6所述的生产工艺，其特征在于，所述反应液流速选自0.1～10BV/h，优选0.2～1BV/h。
10.如权利要求6所述的生产工艺，其特征在于，所述反应pH值为6.5～7.5。
...【技术特征摘要】
1.一种双功能ppnk固定化酶的制备方法，其特征在于，先选择氨基环氧载体，加入戊二醛活化制得醛基环氧树脂，然后对ppnk酶进行固定化，形成席夫碱形式的固定化衍生物，最后用硼氢化钠还原得到双功能ppnk固定化酶。
2.一种如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氨基环氧载体选自氨基环氧琼脂糖或氨基环氧树脂。
3.一种如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述氨基环氧树脂选自lxte-707、sepabeads ec hfa。
4.一种如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述戊二醛浓度选自1％～5％。
5.一种如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应需要控制ph值，...
【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，请求不公布姓名，
申请(专利权)人：尚科生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
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