【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物工程领域，涉及一种神经干细胞，具体来说是一种神经干细胞及其制备方法。
技术介绍
1、神经系统疾病种类众多，如以tau病理为特征的阿尔兹海默症(alzheimer'sdisease，ad)，以路易小体(lewybody)为特征之一的帕金森病(parkinson's disease，pd)，以小胶质细胞激活和运动神经元凋亡为特征的肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateralsclerosis，als)，以缺血或出血为特征的脑卒中(stroke)，以及多种复合因素导致的脊髓损伤和自闭症(autistic disorder)[2]。神经系统疾病发病率高，发病周期几乎覆盖所有年龄段，目前仍无有效治疗手段，重要的原因之一是出生后神经系统再生非常困难。神经发生指神经干细胞经过增殖成为定向祖细胞，逐渐迁移、分化成神经元并参与环路建立从而产生神经功能的过程[3]。近年研究发现，哺乳动物成年神经发生持续终生，主要存在于两个特定区域：侧脑室侧壁和海马齿状回区域。成体期海马神经发生对情绪调节和认知功能有非常重要的作用，侧脑室侧壁的神经发生对嗅觉功能维持、嗅觉神经环路建立，和嗅觉依赖的社交、认知、情绪调节都具有重要作用[4]。
2、外源性神经干细胞的治疗已经应用于多种神经系统疾病，如小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell，esc)可以整合到大鼠pd模型的纹状体中，分化为多巴胺能(dopamine，da)神经元，并恢复运动功能的丧失[5]；人类诱导多能干细胞(inducedpluripotent st
3、激活与调控神经系统疾病患者的内源性干细胞，是一种较为安全有效的治疗方法，为众多神经疾病提供了广泛治疗前景，但目前神经干细胞的鉴定和分离仍有较大的困难。
4、神经干细胞(neural stem cell，nsc)是一种神经系统的多能干细胞，可以分化为多种神经细胞。神经干细胞可以从哺乳动物大脑特定区域和脊髓中分离出来，可以重建神经环路、修复神经组织。因此，神经干细胞在神经退行性疾病、遗传性中枢神经系统疾病、中风和脊髓损伤等方面有着广泛的研究价值。
5、目前从神经组织中鉴定出真正的神经干细胞仍有较大困难。有研究认为，神经干细胞可以从形态学特征、特异抗原表达和分化潜能等方面鉴定；但干细胞体外培养环境与体内干细胞微环境差距悬殊，细胞难以长期维持其干细胞特性，且大部分体外鉴定的神经干细胞并不能在体内被长期追踪，难以确定神经干细胞在体内发挥的真实作用。
6、prom1基因编码白是cd133，为首个发现的五次跨膜糖蛋白[7]，最初被用作造血祖细胞及肿瘤干细胞的标志物，cd133能介导pi3k/akt、akt、src-fak等信号通路，影响干细胞细胞的功能[8]；cd133不仅是人源胶质瘤干细胞的标志物，也是人源神经干细胞的标志物，2008年有研究揭示成体prom1+神经干细胞可以在体内增殖、迁移、分化[1]。
7、pdgfrβ基因是血小板衍生生长因子受体β(pdgfrβ)，又名cd140b，和结构同源蛋白pdgfrα都是受体酪氨酸激酶(rtk)iii类亚家族中的成员。pdgf是一种重要的有丝分裂原，可以通过二硫键连接pdgfr-α链和pdgfr-β链，形成同源或异源二聚体蛋白，pdgfrβ高亲和力结合pdgf-bb。pdgfrβ高表达在神经系统的血管周细胞内，参与神经血管单元的组成，维持血脑屏障(bloodbrain barrier，bbb)。有研究发现，pdgfrβ在成体静息态神经干细胞中高表达，随着干细胞逐渐激活，pdgfrβ的表达逐渐下降[9]。
8、本专利技术聚焦于神经干细胞的分类鉴定，专利技术了一种新型鉴定与分离神经干细胞的方法，且经过体内长期谱系追踪，鉴定这群神经干细胞在体内发挥着重要作用。
技术实现思路
1、针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种神经干细胞及其制备方法，所述的这种神经干细胞及其制备方法要解决现有技术中的神经干细胞用于治疗神经损伤的效果不佳的技术问题。
2、本专利技术提供了一种神经干细胞，这种神经干细胞同时表达pdgfrβ和prom1的基因。
3、本专利技术还提供了一种神经干细胞的制备方法，包括如下步骤：
4、1)采用两种品系的转基因小鼠pdgfrβ-cre转基因鼠和cag-frt-stop-frt—lox-stop-lox-tdtomato(此品系小鼠简称：ai65d)报告基因小鼠，所述的pdgfrβ-cre转基因鼠体内所有表达pdgfrβ基因的细胞均表达cre重组酶；所述的cag-frt-stop-frt—lox-stop-lox-tdtomato(ai65d)报告基因小鼠脑内所有cag基因表达的细胞均表达一段frt-stop-frt—lox-stop-lox-tdtomato序列，两种转基因小鼠杂交产生pdgfrβ-cre；ai65d双杂合实验小鼠；
5、2)一个构建“paav-mp2-flpo-wpre”病毒的步骤，mp2是prom1基因特异的启动子，构建一个载体，所述的载体骨架为“ef1α-flpo-wpre-hgh-polya”，ef1α两端的酶切位点分别是mlui和bamhi，合成含这两个酶切位点的mp2启动子大片段，通过酶切和酶连反应，将载体骨架中“ef1α”启动子替换为“mp2”启动子，最终构建“mp2-flpo-wpre-hgh-polya”质粒，后续选择血清型为9型的aav病毒载体，进行病毒包被，得到“paav-mp2-flpo-wpre”工具病毒；
6、3)分离pdgfrβ-cre；ai65d双杂合转基因小鼠侧脑室侧壁神经干细胞，神经干细胞体外培养传代后，加入paav-mp2-flp-wpre病毒和他莫昔芬的活性代谢物4-oh-他莫昔芬(4-oh-tamoxifen，4-oh-tam)；得到同时表达pdgfrβ和prom1的基因的神经干细胞。
7、根据jackson laboratory公司提供的已知信息，从pdgfrβ-cre；ai65d双杂合转基因小鼠分离的神经干细胞，基因组中同时有pdgfrβ-cre和cag-frt-stop-frt
8、-lox-stop-lox-tdtomato两段序列表达。因此，感染paav-mp2-fllp-wpre的细胞病毒所含的flp序列见表1，mp2序列参照文献提供[1,10]。
9、表1flp序列：5’→3’
10、
11、表2mp2序列：5’→3’
12、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种神经干细胞，其特征在于，同时表达Pdgfrβ和Prom1基因。
2.权利要求1所述的一种神经干细胞的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
【技术特征摘要】
1.一种神经干细胞，其特征在于，同时表达pdgfrβ和prom1基因。
...【专利技术属性】
技术研发人员：孙毅，杨雪娇，朱文敏，
申请(专利权)人：上海艾波康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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