【技术实现步骤摘要】
本专利技术总体涉及用于寡糖或多糖的生产的方法，如，例如，经由微生物发酵的寡糖或多糖的生产，以及尤其涉及水解酶在这类方法中的应用。
技术介绍
1、寡糖的商业化生产，连同新颖的生物制造技术开发一起在过去的多年来已变得越来越令人感兴趣。如今，使用寡糖，例如作为功能性食品组分、营养添加剂或作为营养品(营养保健品，nutraceuticals)。传统上，寡糖被定义为2个或更多(通常多达10个)单糖的聚合物，然而，此外多达20至25个单糖的聚合物经常与它们同化(混用，assimilate)。尤其是，前生物寡糖(前生命寡糖，prebiotic oligosaccharide)是高度令人感兴趣的，因为它们表示非龋齿性的(noncariogenic)和不易消化的化合物，其刺激人体胃肠道微生物区系(微生物群落，microflora)的生长和发育。
2、目前，寡糖通过化学糖基化和使用糖基转移酶从头合成进行合成，或者它们可以衍生自多糖的化学降解、物理降解或生物降解。
3、今天，合成或分离自植物多糖的低聚果糖(果寡糖，果聚糖，fructooligosaccharide)和低聚半乳糖(半乳糖寡糖，galactooligosaccharide)代表最丰富生产的寡糖。然而，由于优越的健康益处，对人乳寡糖(hmo)作为营养品的兴趣在过去的多年来已强烈地增加。公认的是，hmo有助于人体针对人病原体的防御机制，特定的肠道菌群(微生物群系，microbiome)的确立，以及免疫系统的出生后刺激。虽然hmo是由婴儿食用，但已被人们接受的是，在出生
4、已经长期已知的是人母乳，除乳糖之外，还包含称作人乳寡糖(hmo)的寡糖的复杂混合物，其表示相对于成分和数量而言的独特的寡糖复杂混合物。今天，多于80种hmo化合物已在结构上进行表征，并且除了少数例外，它们是通过在还原端处的乳糖部分来表征并且经常在非还原端含有岩藻糖和/或唾液酸。通常，由其衍生hmo的单糖是d-葡萄糖、d-半乳糖、n-乙酰基葡糖胺、l-岩藻糖和唾液酸。
5、最著名的寡糖是2'-岩藻糖基乳糖和3'-岩藻糖基乳糖，它们一起可以贡献多达总的hmo部分的1/3。在人乳中存在的另外的著名的hmo是乳-n-四糖、乳-n-新四糖(neotetraose)和乳-n-岩藻糖五糖(fucopentaose)。除这些中性寡糖之外，在人乳中还可以发现酸性hmo，如，例如3'-唾液酸乳糖(唾液乳糖，sialyllactose)、6'-唾液酸乳糖和3-岩藻糖基-3'-唾液酸乳糖、二唾液酸-乳-n-四糖等。这些结构与上皮细胞表面糖复合物的表位，路易斯(lewis)组织血型抗原，如路易斯x(lex)密切相关，并且hmo与上皮表位的结构同源性导致针对抗细菌病原体的保护特性。
6、除提到的在肠道中的局部效应之外，hmo还表现出通过进入全身循环(体循环，systemic circulation)在婴儿中引发全身效应。此外，hmo对蛋白-碳水化合物相互作用的影响，例如，选择素-白细胞结合，可以调节免疫反应并且降低炎症反应。
7、由于前生物寡糖(尤其是hmo)的充分研究的有益的特性，连同它们的有限的可获得性，有效的商业生产，即大规模生产是非常需要的。
8、然而，如今的主要缺点，在大多数情况下是缺乏有效的寡糖生产。如上所述，借助于利用酶工程或化学工程的合成，或多糖解聚作用(利用物理、化学或酶方法)，寡糖可以产生自低聚物工程。
9、由于具有类似的化学反应性的若干羟基的存在，寡糖的化学合成已被证明是具有挑战性的。因此，在寡糖的化学合成中，糖结构单元必须首先加以选择性地保护以控制化学类似基团的反应性，然后偶联，并且最后脱保护(去保护，de-protect)，以获得期望的寡糖。即使期望的寡糖的小规模合成是可能的，但开发合成途径通常是费时的、技术上具有挑战性并且经常是极其昂贵的。酶促合成或化学和酶促合成的组合提供相对于纯化学合成途径的显著的优点。通过酶促合成，已获得若干人乳寡糖，如2'-岩藻糖基乳糖、乳-n-四糖、乳-n-新四糖或3'-唾液酸乳糖。除酶促合成之外，通向寡糖的发酵途径也证明是成功的，并且已经可以做到通过发酵方式，以相当的产量提供寡糖(包括hmo)。
10、另外，如前面提到的，借助于寡糖结构的化学或生化合成，这比例如合成其它生物聚合物，如肽和核酸更加困难，经常产生寡糖混合物，该寡糖混合物含有非期望的寡糖，这些非期望的寡糖需要从期望的寡糖中分离或除去。这也同样适用于经由微生物发酵产生的寡糖，因为在那些过程中，在反应混合物/细胞培养基(含有待发酵的微生物)中将发现高含量的副产物、中间产物或甚至起始底物。
11、针对该背景，非常需要用于生产期望的寡糖，尤其是hmo的有效的方法和过程，其中上述有效的生产具有较高的医疗相关性以及商业影响。
技术实现思路
1、通过本专利技术，经由在从混合物中纯化所产生的期望的寡糖中使用一种或多种挂糖苷酶，用于降解非期望的寡糖或代谢产物或未使用的底物，此目的和其它的目的已经解决，该混合物含有产生的期望的寡糖以及，在适用情况下，非期望的寡糖或代谢糖类产物(在所述2'-岩藻糖基乳糖的生产中所产生)，和/或在所述2'-岩藻糖基乳糖的生产中使用的未使用的糖底物。
2、通过利用宿主微生物生产寡糖的方法来进一步解决上述目的，其中该寡糖并不天然存在于所述宿主细胞中，上述方法包括以下步骤：a)在容许生产所述2'-岩藻糖基乳糖的条件下和培养基中，培养适用于生产期望的寡糖的宿主微生物，借此生产寡糖以及，在适用情况下，生产生物合成中间体和/或副产物；b)使用培养宿主微生物的培养基中的糖苷酶，以降解生物合成糖中间体和/或糖副产物和/或未使用的糖底物；以及c)回收期望的寡糖。
3、根据本专利技术，在用于生产寡糖的过程中使用糖苷酶，其中糖苷酶用于降解和/或阻碍在期望的寡糖的生产中所产生的不期望的副产物、未使用的起始底物和中间产物；因此，根据本专利技术，糖苷酶用于从含有期望的寡糖和其它不需要的碳水化合物部分的混合物中纯化期望的寡糖。
4、根据本专利技术，糖苷酶可以用于生产期望的寡糖的发酵过程以及用于纯化或分离通过体外寡糖合成反应或通过化学合成或它们的组合所获得的寡糖混合物。
5、借助于糖苷酶，可以实现的是，例如除期望的寡糖之外的其它(寡)糖可以进行代谢，上述其它(寡)糖是在期望的寡糖的合成过程中在微生物中所产生的，并且上述其它寡糖干扰期望的寡糖的纯化步骤。
6、到目前为止尚未描述糖苷酶在用于生产期望的寡糖的过程中的用途。与此相反，在目前应用的方法(即用于hmo的发酵)中，通过添加乳糖作为用于合成的底物。为了防止添加的乳糖的降解，在发酵菌株中强烈避免β-半乳糖苷酶以及其它糖苷酶的反应。因此，在发酵中使用β-半乳糖苷酶缺陷型菌株(参见，例如dumon et al.,(2004)biotechnol.prog.20,412-419本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种使用宿主微生物用于生产2'-岩藻糖基乳糖的方法，其中所述2'-岩藻糖基乳糖不天然存在于所述宿主微生物中，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述2'-岩藻糖基乳糖回收自培养的所述宿主微生物的上清液，所述上清液通过离心培养的所述宿主微生物以获得上清液和宿主微生物沉淀而获得，或来自发酵滤液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述宿主微生物选自细菌和酵母菌。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述宿主微生物是大肠杆菌菌株、乳杆菌种或谷氨酸棒杆菌菌株或酵母属菌种菌株。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，采用的所述宿主微生物表达用于半乳糖分解代谢途径且不存在于所述微生物中的蛋白。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在宿主微生物中采用补救途径以将半乳糖转化为其核苷酸活化形式。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，采用的所述宿主微生物是表达用于半乳糖分解代谢途径的蛋白的野生型，其中在所述方法期间，在所述宿主微生物中诱导这类蛋白
...【技术特征摘要】
1.一种使用宿主微生物用于生产2'-岩藻糖基乳糖的方法，其中所述2'-岩藻糖基乳糖不天然存在于所述宿主微生物中，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述2'-岩藻糖基乳糖回收自培养的所述宿主微生物的上清液，所述上清液通过离心培养的所述宿主微生物以获得上清液和宿主微生物沉淀而获得，或来自发酵滤液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述宿主微生物选自细菌和酵母菌。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述宿主微生...
【专利技术属性】
技术研发人员：斯特凡·延内魏因，
申请(专利权)人：科汉森母乳低聚糖股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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