【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及制革场地土壤生物毒性检测方法领域，具体涉及一种基于特殊浸提剂的制革场地土壤生物毒性检测方法。
技术介绍
1、制革场地土壤的污染特征是铬和有机物复合污染，其中总铬含量高，可达59400mg/kg，且主要为三价铬，但也在某些区域含有较高的六价铬可达827mg/kg。超过90%的鞣制工段使用三价铬，在鞣革及后处理后会产生大量的含铬废液及含铬废弃物；同时，制革过程使用种类繁多数量较大的有机物，例如油脂、树脂、单宁、蛋白质等；废液滴漏和固废堆存沥出，成为场地污染主要来源。这些污染物不仅各有其毒性，而且各种污染物质混合、相互作用也会产生潜在的毒性；因此，综合的毒性评价是必不可少的。现有关于制革场地土壤的检测技术, 局限于土壤中部分有害成分如氨氮、铬(ⅵ)、硫化物的含量测定, 针对每一种有害成分, 萃取方式各异。例如iso/ts 14256-1-2003采用氯化钾溶液，萃取土壤中的硝酸盐、亚硝酸盐和铵; hj 833-2017用强酸，将硫化物转化为硫化氢吹出进而测定其含;iso 15192-2010采用强碱性提取液，提取出样品中的铬(ⅵ)，未考虑在还原或氧化废物基质的情况下, 铬(ⅲ)对测试结果的影响。这些土壤浸提方法，未充分考虑在环境温度、ph和土壤基质的变化下, 土壤中各种成分在萃取过程中发生进一步转化的风险, 进而对土壤毒性的测试结果造成影响。
2、我国是皮革生产的大国，产业结构的调整已促进制革产业形成了上中下游产品相互配套的产业集群，而部分中小型制革企业逐渐关停。而2016年发布的《土壤污染防治行动计划》，明
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的无法准确测试cr(iii)及cr(vi)含量、而生态毒性筛查操作复杂、时间长、检测成本较高的缺点，提供一种基于发光细菌的操作易控、经济实用的制革场地土壤生物毒性检测方法。
2、本专利技术提供了一种基于特殊浸提剂的制革场地土壤生态毒性检测方法，包括以下步骤：
3、（1）预处理：将土壤风干、压碎、筛分、均质化处理后取样进行恒温恒湿处理；
4、（2）浸提：将预处理后的土壤加入浸提剂，浸提剂为含有0.1~0.3% wt nacl和1%aeo的一定ph值溶液，恒温水平震荡一定时间，过滤得浸提液；
5、（3）毒性检测：向浸提液中加入氯化钠，使氯化钠浓度为2.5% wt，调节ph 7.0±0.2，然后再加入培养的测试用菌密度的新鲜发光细菌液，混匀后静置，测定发光强度；
6、（4）毒性表达：以2.5% wt nacl溶液的发光强度为对照，计算静置后浸提液的相对发光强度。
7、进一步的，所述预处理方法具体为：将土壤风干后过筛为2mm筛网并取样，于45 ℃干燥48小时后，置于标准空气中，20±2°c，相对湿度65±5%恒温恒湿48h，保存备用。
8、进一步的，所述土壤为制革场地的土壤。
9、进一步的，所述步骤（2）中，浸提剂与土壤的液固比(ml/g)为2：1~10：1，恒温25~30°c，水平60~100 rpm振荡浸提18~48 h，过滤方法为通过0.45 um的滤膜。
10、进一步的，所述浸提剂为0.1~0.3% wt nacl和1%aeo的混合溶液，并用h2so4和naoh调节ph为4~9。
11、进一步的，所述发光细菌液中的发光细菌为明亮发光杆菌t3。
12、进一步的，所述发光细菌液的培养方法为：
13、（1）制备发光细菌培养基：取胰蛋白胨5.0 g/l，酵母粉5.0 g/l，na2hpo4 5.0g/l，k2hpo4 5.0g/l，nacl 30g/l，甘油3.0 g/l，去离子水溶解，调节ph至7.0；
14、（2）培养过程：取明亮发光杆菌t3接种于装有培养基的锥形瓶中，置于20℃、200rpm振荡的摇床，培养18~20 h后，立即取发光效果最好的菌种二次接种，再置于20℃、200rpm摇床，每2 h测定新鲜菌液发光强度，培养18~20 h达生长对数稳定期，用于测试。
15、进一步的，所述测试用菌密度的确定方法为：取培养18~20 h的生长达对数稳定期的发光细菌新鲜菌液， 以2.5% wt. nacl稀释至不同菌密度，各取50 ul依次加入950 ul1.23 mg/l znso4溶液，含2.5% wt. nacl，静置15 min，利用lumifox6000生物毒性测试仪测定发光强度，平行测定3次，以2.5% wt. nacl溶液为空白，使相对发光强度为50±5％的菌液，为测试用菌密度。
16、进一步的，所述步骤（4）以2.5 % wt. nacl对照样的发光强度平均值i0，和待检测样品的发光强度平均值i，按r=i/i0 ×100%计算浸提原液的相对发光强度r；相对发光强度r越大，毒性越小。
17、本专利技术具有以下有益效果：
18、以氯化钠调节离子强度、硫酸或氢氧化钠调节ph、aeo调节表面活性，浸提土壤中弱结合的重金属和有机物，有效避免了浸提剂与土壤中可浸提组分的反应，准确地评估了土壤中可迁移有机物和cr的毒性效应，操作简便有效。
19、本专利技术采用的发光细菌检测法，建立在细菌发光生物传感技术基础上。明亮发光杆菌为海洋菌，在一定盐浓度和ph范围，处于生长对数期的细菌，发光能力强且发光稳定，当环境变化或有毒物质存在时，细菌荧光素酶失活或细胞呼吸被抑制，发光减弱，减弱的程度与有毒物质毒性的大小正相关。发光细菌法成本低廉，具有检测快速、灵敏度高、适应性强等优点。因此本方法完全能够用于制革场地土壤生态毒性检测。
20、本专利技术以低毒性的标准毒性参照物1.23 mg/l znso4确定测试的新鲜菌液密度，使检测结果稳定，重复性好。
21、本方法利用发光细菌法进行检测，样品与发光细菌的反应时间短，能够迅速获得检测结果，适应大批量样品的快速检测，大大缩短了综合毒性的检测时间，提高了检测效率和准确度。
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1.一种制革场地土壤生物毒性检测方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：
2.一种制革场地土壤综合毒性的检测方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述预处理方法具体为：将土壤风干后过筛为2mm筛网并取样，于45 ℃干燥48小时后，置于标准空气中，20±2°C，相对湿度65±5%恒温恒湿48h，保存备用。
4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中，浸提剂由H2SO4和NaOH调节pH值至5.5~10.5， 与土壤的液固比（mL/g）为2：1~10：1，恒温25~30°C，水平60~100rpm振荡浸提18~48 h，过滤方法为通过0.45 um的滤膜。
5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述浸提剂为0.1~0.3% wt的NaCl溶液，并含有1%的AEO。
6.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述发光细菌液中的发光细菌为明亮发光杆菌T3。
7.根据权利要求1或2或7所述的检测方法，其特征在于，所述发
8.根据权利要求1或2或8所述的检测方法，其特征在于，所述测试用菌密度的确定方法为：取培养18~20 h的生长达对数稳定期的发光细菌新鲜菌液， 以2.5% wt. NaCl稀释至不同菌密度，各取50 uL依次加入950 uL 1.23mg/L ZnSO4溶液，含2.5% wt. NaCl，静置15min，利用LumiFox6000生物毒性测试仪测定发光强度，平行测定3次，以2.5% wt. NaCl溶液为空白，使相对发光强度为50±5％的菌液，为测试用菌密度。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（4）以2.5 % wt. NaCl对照样的发光强度平均值I0，和待检测样品的发光强度平均值I，按R=I/I0 ×100%计算浸提原液的相对发光强度R；相对发光强度R越大，毒性越小。
10.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（4）以待检测样品稀释的系列浓度为横坐标，以相对发光强度R为纵坐标，作剂量效应曲线，并从该曲线上读取相对发光强度为50%时所对应的浓度，即半数相对发光强度浓度EC50；EC50值越大，毒性越小。
...【技术特征摘要】
1.一种制革场地土壤生物毒性检测方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：
2.一种制革场地土壤综合毒性的检测方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述预处理方法具体为：将土壤风干后过筛为2mm筛网并取样，于45 ℃干燥48小时后，置于标准空气中，20±2°c，相对湿度65±5%恒温恒湿48h，保存备用。
4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中，浸提剂由h2so4和naoh调节ph值至5.5~10.5， 与土壤的液固比（ml/g）为2：1~10：1，恒温25~30°c，水平60~100rpm振荡浸提18~48 h，过滤方法为通过0.45 um的滤膜。
5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述浸提剂为0.1~0.3% wt的nacl溶液，并含有1%的aeo。
6.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述发光细菌液中的发光细菌为明亮发光杆菌t3。
7.根据权利要求1或2或7所述的检测方法，其特征在于，所述发光细菌液的...
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