【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生化合成领域。提供了用于生产郁金香素a的方法、用于生产郁金香素a的重组细胞或生物体、用于生产郁金香素a的酶、以及用于表达这些酶的核酸。
技术介绍
1、郁金香素a(α-亚甲基-γ-丁内酯)是一种天然存在的乙烯基单体，存在于郁金香(tulipa gesneriana)以及郁金香属(tulipa)、猪牙花属(erythronium)、顶冰花属(gagea)、六出花属(alstroemeria)、竹叶吊钟属(bomarea)和绣线菊属(spiraea)中。郁金香素在植物中起到防御化学物质的作用，并能引起人过敏反应。
2、郁金香素的外亚甲基双键允许单体进行链增长聚合，形成高分子化合物聚(郁金香素a)。郁金香素a的聚合方式类似于甲基丙烯酸甲酯(mma)，后者是一种用于生产聚甲基丙烯酸甲酯丙烯酸塑料(pmma)(也称为丙烯酸玻璃、透明塑胶(perspex)或有机玻璃(plexiglas))和甲基丙烯酸酯-丁二烯-苯乙烯(mbs)的聚合物。因此，郁金香素a被认为是甲基丙烯酸甲酯的环状类似物，并且有潜力取代基于油的mma单体作为可持续的替代品。作为一种天然存在的乙烯基，郁金香素a赋予所得聚合物生物相容性、生物降解性、环境友好性和可再生特性。郁金香素a容易与苯乙烯、甲基丙烯酸酯单体或丙烯腈等共聚合剂共聚合。在聚合物生产行业中，郁金香素用于生产热塑性塑料、涂料和脂肪族聚酯等材料，脂肪族聚酯是技术上重要的一类可生物降解聚合物。包含郁金香素共聚物或共聚酯的组合物例如用于铸造玻璃和模制材料、汽车涂层和饰面、热塑性树脂和可植入医疗装
3、在植物中，郁金香素源自郁金香苷，郁金香苷是由d-葡萄糖和4′-羟基-2′-亚甲基丁酰基和/或3′，4′-二羟基-2′-亚甲基丁酰基侧链构成的糖酯。6-郁金香苷a和b可以自发形成其内酯化苷元，郁金香素a和b。郁金香素a和b具有抗微生物活性和杀昆虫活性，并可作为植物的化学防御机制。郁金香苷储存在植物的所有部分，并且只有在植物感染或受伤时，郁金香苷转化酶(tce)催化郁金香苷转化为郁金香素，郁金香苷才会转化为郁金香素。因此，植物中郁金香素的水平通常较低或几乎检测不到，并且提取郁金香素a并不是经济上可行的郁金香素a生产选择。
4、wo 2016/196962提出了一种重组微生物来生产官能化的α-取代的丙烯酸酯和c4-二羧酸酯。
5、由于其作为甲基丙烯酸甲酯的可持续替代品的潜力，郁金香素a是一种重要的工业聚合物。因此，需要一种用于以工业规模生产郁金香素a的改进方法，包括这种生产过程所需的材料，例如酶、重组细胞或生物体，以及用于生产方法中使用的酶表达的核酸。本文所述的专利技术提供了郁金香素a生产的方法、用于郁金香素a生产的重组细胞或生物体、在这些方法中或由这些细胞或生物体使用的酶以及编码这些酶的核酸。专利技术人出人意料地发现，本专利技术的重组细胞或生物体在一锅生物合成中从发酵原材料生产郁金香素a。
6、专利技术目的和
技术实现思路
7、本专利技术涉及一种从衣康酸生产郁金香素a的方法。从衣康酸衍生郁金香素a的途径涉及三个酶催化反应步骤，因此，本专利技术包括第一、第二和第三酶。任选地，可以使用第四酶。
8、第一反应涉及从衣康酸和coa源形成中间体衣康酰-coa。可替代地，第一反应还可涉及从衣康酸形成中间体衣康酸半醛。
9、因此，在第一方面，本专利技术涉及从衣康酸生产郁金香素a的方法，该方法包括将包含衣康酸的反应混合物与选自至少一种酰基-coa合成酶、至少一种-coa转移酶和至少一种羧酸还原酶的第一酶接触。
10、在优选的实施例中，酰基-coa合成酶选自由琥珀酰-coa合成酶(succd)和苹果酸-coa连接酶(mtkab)组成的组。在另一个实施例中，coa-转移酶是衣康酸-coa转移酶(ict)。
11、从衣康酸合成衣康酰-coa后，衣康酰-coa进一步反应形成中间体衣康酸半醛。
12、因此，在本专利技术的另一方面，生产郁金香素a的方法进一步包括使反应混合物与第二酶接触，其中第二酶是至少一种氧化还原酶，优选酰基-coa还原酶。在一个实施例中，氧化还原酶是酰基-coa还原酶，优选选自琥珀酰-coa还原酶(scr)和丙二酰-coa还原酶(mcr)。
13、因此，衣康酸半醛通过使用酰基-coa合成酶或-coa转移酶作为第一酶并使用第二酶的两步反应形成，或者通过使用羧酸还原酶作为第一酶而不使用第二酶的直接形成来形成。一旦衣康酸半醛存在，就会使用第三酶进行反应，催化形成2-亚甲基-4-醇-丁酸。
14、因此，在本专利技术的另一方面，用于生产郁金香素a的方法进一步包括使反应混合物与第三酶接触，其中第三酶是至少一种选自下组的氧化还原酶，该组由以下组成：醇脱氢酶、乳醛还原酶、3-磺基乳醛还原酶、琥珀酸半醛还原酶和醛糖/醛还原酶。在优选的实施例中，第三酶是醇脱氢酶。在另一优选的实施例中，第三酶是3-磺基乳醛还原酶。
15、2-亚甲基-4-醇-丁酸能够通过内酯化自发形成郁金香素a。然而，任选地，可以提供第四酶来催化内酯形成。因此，在本专利技术的另一个方面，用于生产郁金香素a的方法任选进一步包括使反应混合物与选自至少一种硫酯酶和至少一种内酯酶的第四酶接触。
16、在一个实施例中，第四酶是硫酯酶并且郁金香素a的形成通过中间体2-亚甲基-4-醇-丁酰-coa发生，优选地其中本专利技术的第一酶催化2-亚甲基-4-醇-丁酸形成2-亚甲基-4-醇-丁酰-coa(图4b)。
17、2-亚甲基-4-醇-丁酸也可以与酶接触来制备其酯。因此，在替代实施例中，可以提供第四酶来催化酯形成。因此，在本专利技术的另一个方面，用于生产郁金香素a的方法任选进一步包括使反应混合物与选自以下的第四酶接触：至少一种酰基转移酶、至少一种羧酸酯酶、至少一种肉毒碱乙酰转移酶、至少一种半乳糖苷o-乙酰转移酶和至少一种醇乙酰转移酶，从而产生4-乙酰氧基-2-亚甲基丁酸(图16)。4-乙酰氧基-2-亚甲基丁酸可以自发地、化学地或通过使用内酯酶和硫酯酶转化为郁金香素a。
18、生产郁金香素a的一个或多个或全部步骤可以在包含至少一种本专利技术的酶的重组细胞或生物体中进行。
19、因此，本专利技术的一个方面涉及能够合成郁金香素a的重组细胞或生物体，其包含一种或多种编码第一酶的核酸分子，其中该第一酶选自至少一种酰基-coa合成酶、至少一种coa-转移酶和至少一种羧酸还原酶。
20、本专利技术的另一方面涉及能够合成郁金香素a的重组细胞或生物体，其中该重组细胞或生物体进一步包含一种或多种编码第二酶的核酸分子，其中该第二酶是至少一种氧化还原酶。在一个实施例中，氧化还原酶是酰基-coa还原酶，优选选自琥珀酰-coa还原酶(scr)和丙二酰-coa还原酶(mcr)。
21、本专利技术的另一方面涉及能够合成郁金香素a的重组细胞或生物体，其中该重组细胞或生物体进一步包含一种或多种编码第三酶的核酸分子，其中该第三酶是选自下组的至少一种氧化还原酶，该组由以下组成：醇脱氢酶、乳醛还原本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种从衣康酸生产郁金香素A(α-亚甲基-γ-丁内酯)的方法，该方法包括将包含衣康酸的反应混合物与选自至少一种酰基-CoA合成酶、至少一种CoA-转移酶和至少一种羧酸还原酶的第一酶接触。
2.如权利要求1所述的方法，其中该第一酶是至少一种酰基-CoA合成酶或至少一种CoA-转移酶，该方法进一步包括使该反应混合物与第二酶接触，其中该第二酶是至少一种氧化还原酶，优选酰基-CoA还原酶。
3.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括使该反应混合物与第三酶接触，其中该第三酶是至少一种选自下组的氧化还原酶，该组由以下组成：醇脱氢酶、乳醛还原酶、3-磺基乳醛还原酶、琥珀酸半醛还原酶和醛糖/醛还原酶。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括使该反应混合物与选自至少一种硫酯酶和至少一种内酯酶的第四酶接触。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括使该反应混合物与选自以下的第四酶接触：至少一种酰基转移酶、至少一种羧酸酯酶、至少一种肉毒碱乙酰转移酶、至少一种半乳糖苷O-乙酰转移酶和至少一种醇乙
6.一种能够生产郁金香素A(α-亚甲基-γ-丁内酯)的重组细胞或生物体，该重组细胞或生物体包含一种或多种编码第一酶的核酸分子，其中该第一酶选自至少一种酰基-CoA合成酶、至少一种CoA-转移酶和至少一种羧酸还原酶。
7.如权利要求6所述的重组细胞或生物体，其中该重组细胞或生物体进一步包含一种或多种编码第二酶的核酸分子，其中该第二酶是至少一种氧化还原酶。
8.如权利要求6或7中任一项所述的重组细胞或生物体，其中该重组细胞或生物体进一步包含一种或多种编码第三酶的核酸分子，其中该第三酶是至少一种选自下组的氧化还原酶，该组由以下组成：醇脱氢酶、乳醛还原酶、3-磺基乳醛还原酶、琥珀酸半醛还原酶和醛糖/醛还原酶。
9.如权利要求6-8中任一项所述的重组细胞或生物体，其中该重组细胞或生物体进一步包含一种或多种编码第四酶的核酸分子，其中该第四酶选自至少一种酰基转移酶、至少一种羧酸酯酶、至少一种肉毒碱乙酰转移酶、至少一种半乳糖苷O-乙酰转移酶和至少一种醇乙酰转移酶。
10.如权利要求6-8中任一项所述的重组细胞或生物体，其中该重组细胞或生物体进一步包含一种或多种编码第四酶的核酸分子，其中该第四酶选自至少一种硫酯酶和至少一种内酯酶。
11.如权利要求6-10中任一项所述的重组细胞或生物体，其中该重组细胞或生物体使用衣康酸作为郁金香素A合成的底物，优选地其中该衣康酸源自该重组细胞或生物体对包含纤维素、半纤维素和/或淀粉的原材料的发酵。
12.如权利要求6-11中任一项所述的重组细胞或生物体，其中该重组细胞生物体选自由以下组成的组：大肠杆菌、氧化葡糖杆菌、天蓝色链霉菌、嗜热链球菌、恶臭假单胞菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、筑波假酵母菌、玉蜀黍黑粉菌、黑曲霉、土曲霉、里氏木霉、毕赤酵母、酿酒酵母、粟酒酵母和解脂耶氏酵母(解脂假丝酵母)，优选地，该重组细胞或生物体是大肠杆菌野生型、大肠杆菌菌株Ita23、大肠杆菌Ita36A或筑波假酵母菌。
13.如权利要求1-5中任一项所述的方法或如权利要求6-12中任一项所述的重组细胞，其中该第一酶是
14.如权利要求1-5中任一项所述的方法或如权利要求6-12中任一项所述的重组细胞，其中该第一酶是琥珀酰-CoA合成酶SucCD，其中SucCD由两个亚基SucC和SucD组成，其中该SucC亚基包含与根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且其中该SucD亚基包含与根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。
15.如权利要求2-5中任一项所述的方法或如权利要求7-12中任一项所述的重组细胞，其中该第二酶是选自琥珀酰-CoA还原酶(Scr)和丙二酰-CoA还原酶(Mcr)的酰基-CoA还原酶，优选地其中该酰基-CoA还原酶是琥珀酰-CoA还原酶Scr，其中Scr包含与根据SEQ IDNO：26的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。
16.如权利要求3-5中任一项所述的方法或如权利要求8-12中任一项所述的重组细胞，其中该第三酶是醇脱氢酶，其中该醇脱氢酶包含与根据SEQ ID NO：42的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。
17.如权利要求3-5中任一项所述的方法或如权利要求8-12中任一项所述的重组细胞，其中该第三酶是3-磺基乳醛还原酶，其中该3-磺基乳醛还原酶包含与根据SEQ ID NO...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种从衣康酸生产郁金香素a(α-亚甲基-γ-丁内酯)的方法，该方法包括将包含衣康酸的反应混合物与选自至少一种酰基-coa合成酶、至少一种coa-转移酶和至少一种羧酸还原酶的第一酶接触。
2.如权利要求1所述的方法，其中该第一酶是至少一种酰基-coa合成酶或至少一种coa-转移酶，该方法进一步包括使该反应混合物与第二酶接触，其中该第二酶是至少一种氧化还原酶，优选酰基-coa还原酶。
3.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括使该反应混合物与第三酶接触，其中该第三酶是至少一种选自下组的氧化还原酶，该组由以下组成：醇脱氢酶、乳醛还原酶、3-磺基乳醛还原酶、琥珀酸半醛还原酶和醛糖/醛还原酶。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括使该反应混合物与选自至少一种硫酯酶和至少一种内酯酶的第四酶接触。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括使该反应混合物与选自以下的第四酶接触：至少一种酰基转移酶、至少一种羧酸酯酶、至少一种肉毒碱乙酰转移酶、至少一种半乳糖苷o-乙酰转移酶和至少一种醇乙酰转移酶。
6.一种能够生产郁金香素a(α-亚甲基-γ-丁内酯)的重组细胞或生物体，该重组细胞或生物体包含一种或多种编码第一酶的核酸分子，其中该第一酶选自至少一种酰基-coa合成酶、至少一种coa-转移酶和至少一种羧酸还原酶。
7.如权利要求6所述的重组细胞或生物体，其中该重组细胞或生物体进一步包含一种或多种编码第二酶的核酸分子，其中该第二酶是至少一种氧化还原酶。
8.如权利要求6或7中任一项所述的重组细胞或生物体，其中该重组细胞或生物体进一步包含一种或多种编码第三酶的核酸分子，其中该第三酶是至少一种选自下组的氧化还原酶，该组由以下组成：醇脱氢酶、乳醛还原酶、3-磺基乳醛还原酶、琥珀酸半醛还原酶和醛糖/醛还原酶。
9.如权利要求6-8中任一项所述的重组细胞或生物体，其中该重组细胞或生物体进一步包含一种或多种编码第四酶的核酸分子，其中该第四酶选自至少一种酰基转移酶、至少一种羧酸酯酶、至少一种肉毒碱乙酰转移酶、至少一种半乳糖苷o-乙酰转移酶和至少一种醇乙酰转移酶。
10.如权利要求6-8中任一项所述的重组细胞或生物体，其中该重组细胞或生物体进一步包含一种或多种编码第四酶的核酸分子，其中该第四酶选自至少一种硫酯酶和至少一种内酯酶。
11.如权利要求6-10中任一项所述的重组细胞或生物体，其中该重组细胞或生物体使用衣康酸作为郁金香素a合成的底物，优选地其中该衣康酸源自该重组细胞或生物体对包含纤维素、半纤维素和...
【专利技术属性】
技术研发人员：B·纳韦，O·策尔德尔，M·布罗伊尔，S·桑达拉姆，T·厄伯，
申请(专利权)人：巴斯夫欧洲公司，
类型：发明
国别省市：
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