【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物疫苗制备，尤其涉及一种利用生物反应器制备甲型肝炎灭活疫苗的方法。
技术介绍
1、甲型肝炎是由甲型肝炎病毒引起的一种急性自限性疾病，以粪-口途径传播为主，严重者可导致死亡，而目前甲型肝炎在全球部分地区仍有暴发。甲肝灭活疫苗免疫后保护性抗体产生的速度快，保护效果好，接种甲型肝炎疫苗可有效预防和控制该病。
2、人胚肺二倍体细胞(2bs株)来源于女孩肺组织，其生长特性、遗传稳定性、外源因子污染检查、致癌性等特征均已检定合格，适用于甲型肝炎病毒的增殖培养，用其制备的疫苗免疫原性更好、安全性更高。
3、目前市售甲型肝炎灭活疫苗均是使用细胞工厂放大培养，然后加毒收获。经纯化、灭活等工艺后，制成甲型肝炎灭活疫苗。除培养瓶、细胞工厂培养方式外，应用较为成功的是基于聚酯纤维载体的生物反应器培养系统。其中，篮式搅拌系统和载体培养是目前国内贴壁细胞培养使用最多的方式。篮式搅拌系统由篮式搅拌桨构成，气体交换在搅拌桨中间进行，与细胞不接触([1]张元兴，孙祥明、张立、易小萍《动物细胞培养工程》，北京：化学工艺出版社，第1版，2007：70)。片状载体填充在反应器中，供细胞贴壁生长。
4、现阶段国内虽有生物反应器培养二倍体细胞制备病毒的实例，但均为裂解型或分泌型病毒培养，如公开号为：cn102743749a的中国专利技术专利，其申请人为北京天坛生物制品股份有限公司，该专利使用篮式生物反应器制备了人二倍体细胞风疹减毒活疫苗，该技术是使用dmem培养基进行细胞培养，接种风疹病毒后通过连续灌流病毒维持液进行病毒
5、此外，使用微载体在生物反应器中培养人二倍体细胞的技术也有研究。公开号为cn114657118a的中国专利技术专利公开了：使用cytodex1微载体在生物反应器内进行n-1逐级放大培养，接种到下级生物反应物器中，补加培养液进行细胞放大培养。上述培养方法使人二倍体细胞的贴壁率高达95％以上，解决了人二倍体细胞在cytodex1微载体上贴壁率不高容易脱落的问题。
6、但上述现有技术存在以下不足：
7、1、现有工艺是利用细胞工厂培养细胞，其缺点是占地面积大，人员劳动强度大，污染风险高，不同人员操作批间差异较大。
8、2、虽然微载体放大培养人二倍体细胞已取得成果，但甲肝病毒培养周期长，用微载体培养难以维持住细胞，接毒后细胞脱落严重。因此微载体更适用于培养周期短、不需要载体与细胞分离、只收获培养液上清的工艺，不适用于甲肝病毒的培养。
9、3、甲肝病毒属于胞内病毒，与目前已有报道的的收获维持液工艺不同，收获时需要将含病毒的细胞与载体分离。
技术实现思路
1、本专利技术的目的通过使用固定篮式生物反应器并以聚氨酯纤维片状载体为培养介质，使用低血清培养基进行培养，人二倍体细胞可以在片状载体上进行高密度培养，培养一定时间后接种甲型肝炎病毒，经培养收获、抽提、超滤、纯化等步骤后制备甲肝灭活疫苗，以解决上述现有技术中存在的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术首先提供了一种利用生物反应器制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，该方法包括以下步骤：
3、(1)将冻存的人二倍体细胞复苏，在低血清培养液中培养并进行传代扩增，接种至片状载体篮氏生物反应器中继续培养；
4、(2)在篮氏生物反应器中将细胞培养至平台期，更换为无血清维持液，接入moi为0.01-0.1的甲型肝炎病毒，完成病毒接种；
5、(3)完成病毒接种后培养21-27天至病毒增殖高峰期，排出细胞维持液，应用hank’s液清洗细胞，之后向篮氏生物反应器内注入胰蛋白酶消化液进行消化，充分消化后加入含有血清的终止液同时辅以搅拌桨正、反转搅拌，得到病毒收获液，离心后取沉淀即为病毒收获物；
6、(4)将得到的病毒收获物经去氧胆酸钠裂解液裂解后加入peg 6000沉淀，沉淀后加入三氯甲烷抽提，将抽提液层析纯化后灭活，最后经膜包进行超滤浓缩去除灭活剂，得到甲型肝炎灭活疫苗。
7、优选的，所述步骤(1)中的人二倍体细胞为2bs、mrc-5、kmb-17、wi-38中的任意一株。
8、优选的，所述步骤(1)中的培养液包括：低血清培养基和5％新生牛血清。
9、优选的，所述步骤(1)中篮氏生物反应器细胞接种密度为2.5-4×105个/ml；所述篮氏生物反应器内培养条件为：温度：35-37℃、ph值：7.2-7.4、溶氧率：60-70％、搅拌桨速度：60-80r/min。
10、优选的，所述步骤(2)中接入的甲型肝炎病毒为保藏号为:cctcc no.v92004的甲型肝炎病毒l-a-1株。
11、优选的，所述步骤(3)中胰蛋白酶消化液注入量为11-12l，其浓度为0.25％。
12、优选的，所述步骤(3)中完成病毒接种后培养条件为：温度：33-35℃、ph值：7.4-7.6、溶氧率：60-70％、搅拌桨速度：60-80r/min。
13、优选的，所述步骤(3)中离心条件为：2988g-5312g，离心30分钟，离心温度为2-8℃。
14、优选的，所述步骤(4)中去氧胆酸钠裂解液为0.2-0.4％；所述peg 6000溶液浓度为6％-8％。
15、另外，本专利技术还提供了一种所述方法制备的甲型肝炎灭活疫苗。
16、本专利技术的有益效果
17、本专利技术公开了一种利用生物反应器制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
18、1、本专利技术成功建立一种利用生物反应器低血清培养二倍体细胞用于制备甲肝病毒的生产工艺，并确定细胞内甲肝病毒提取及层析纯化工艺。
19、2、利用生物反应器培养细胞，相对于用细胞工厂培养细胞的优势在于：片状载体属于3d结构，表面积更大，细胞可以进行高密度培养，减少批间差异，提高收获率，保证疫苗质量的稳定性与均一性。
20、在生物反应器中培养细胞，操作更为简单，降低操作人员数量和劳动强度，在细胞生长阶段使用低血清培养基(5％血清)，与10％血清的mem培养基相比，能够节约血清成本；在病毒维持培养阶段使用无血清培养基可避免血清批次间的质量差异，降低血清等动物源性添加物的安全风险。
21、4、甲型肝炎病毒属于胞内病毒，收获病毒时需将感染病毒的细胞与载体分离。该专利技术利用生物反应器通过片状载体培养人二倍体细胞，消化时开启培养罐内搅拌桨正、反转搅拌，可以实现载体与带病毒细胞的分离，且回收率可达到70％以上，与细胞工厂培养相比，其病毒感染性滴度和抗原含量结果均无显著性差异(p＞0.05)。
22、5、通过对生物反应器大规模本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用生物反应器制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的人二倍体细胞为2BS、MRC-5、KMB-17、WI-38中的任意一株。
3.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的培养液包括：低血清培养基和5％新生牛血清。
4.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(1)中篮氏生物反应器细胞接种密度为2.5-4×105个/ml；所述篮氏生物反应器内培养条件为：温度：35-37℃、pH值：7.2-7.4、溶氧率：60-70％、搅拌桨速度：60-80r/min。
5.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(2)中接入的甲型肝炎病毒为保藏号为:CCTCCNo.V92004的甲型肝炎病毒L-A-1株。
6.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备甲型肝
7.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(3)中完成病毒接种后培养条件为：温度：33-35℃、pH值：7.4-7.6、溶氧率：60-70％、搅拌桨速度：60-80r/min。
8.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(3)中离心条件为：2988g-5312g，离心30分钟，离心温度为2-8℃。
9.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(4)中去氧胆酸钠裂解液为0.2-0.4％；所述PEG 6000溶液浓度为6％-8％。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法制备的甲型肝炎灭活疫苗。
...【技术特征摘要】
1.一种利用生物反应器制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的人二倍体细胞为2bs、mrc-5、kmb-17、wi-38中的任意一株。
3.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的培养液包括：低血清培养基和5％新生牛血清。
4.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(1)中篮氏生物反应器细胞接种密度为2.5-4×105个/ml；所述篮氏生物反应器内培养条件为：温度：35-37℃、ph值：7.2-7.4、溶氧率：60-70％、搅拌桨速度：60-80r/min。
5.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(2)中接入的甲型肝炎病毒为保藏号为:cctccno.v92...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐艳玲，夏青娟，王昕雷，白鸽，岳立广，李春雷，郑书君，王艺博，张宏丽，李丽莉，
申请(专利权)人：长春生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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