【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别涉及一种新型抗nf-κb重组蛋白的原核表达和抗白血病作用方法。
技术介绍
1、费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病是恶性程度最高的白血病类型之一，虽有伊马替尼、达沙替尼等针对其直接致病基因bcr-abl1的靶向药物，但控制效果远逊于慢性粒细胞性白血病。靶向药物合用泛素-蛋白酶体抑制剂在临床试验中对ph+-all特别是难治病例展示出一定疗效，但一来硼替佐米为代表的泛素蛋白酶体抑制剂毒性较大，二来泛素蛋白酶体抑制剂的耐药问题也不容乐观。泛素蛋白酶体抑制剂抗肿瘤的关键机制之一是抑制iκb泛素化降解从而抑制nf-κb的核转位。鉴于此，探索新的不依赖泛素蛋白酶体的抗nf-κb新手段联合靶向药有望为ph+all的治疗带来全新策略。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种新型抗nf-κb重组蛋白的原核表达和抗白血病作用方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种新型抗nf-κb重组蛋白的原核表达和抗白血病作用方法，所述方法先通过化学合成ha-nlec片段，并克隆至pgex-4t-1表达载体，之后转化bl21de3感受态，最后使用iptg诱导ha-nlec融合蛋白表达；
3、所述ha-nlec片段为：
4、
5、
6、优选的，所述ha-nlec片段融合蛋白表达的实验操作包括以下方法：
7、第一步，首先通过bamhi/xhoi双酶切化学合成的ha-nle
8、第二步，胶回收酶切后ha-nlec片段并纯化；
9、第三步，t4连接酶连接bamhi/xhoi酶切纯化后pgex4t-1载体，体系为：
10、
11、连接完成之后在室温下放置30—60min；
12、第四步，取10ul第三步得到的体系，转入jm109感受态细胞，先在冰上放置30min—60min，之后热激90s，然后再次在冰上冷却2—3min，冷却之后加入900ul无amp+lb培养基，在摇床培养20—40min，经过涂板后，倒置培养12—16h；
13、第五步，挑取第四步倒置培养的单克隆，然后扩大培养，之后提取质粒，并由bamhi/xhoi酶切验证，最后测序；
14、第六步，酶切及测序结果均正确的质粒，转bl21感受态细胞，重复第四步的培养操作；
15、第七步，挑取第六步培养的单克隆，然后扩大培养，利用100μm iptg诱导8—10h后超声裂解，取上清液及包涵体后，再次裂解，进行sds-page电泳，然后进行考马斯亮蓝染色，最后观察上清中是否含有可溶性表达。
16、优选的，所述第一步通过bamhi/xhoi双酶切化学合成的ha-nlec片段之后，进行37℃酶切过夜。
17、优选的，所述第四步热激的温度为40-45℃，所述第四步中摇床培养的温度为35-38℃，所述第四步中倒置培养的温度为36-38℃。
18、优选的，所述第七步中使用iptg诱导操作的温度为24-26℃。
19、优选的，所述第七步可溶性表达判定完整之后，继续制备100μm iptg过夜诱导gst-ha-nlec蛋白，过夜后冰上超声裂解，裂解完全后留样品备用；
20、之后用25％过饱和硫酸铵沉淀蛋白，其中沉淀用pbs重悬，放置冰上备用，离心取上清液继续用66％过饱和硫酸铵沉淀蛋白，所得沉淀再次用pbs重悬，放置冰上待用；
21、最后分别取裂解后样品、在25％过饱和硫酸铵沉淀离心后获得的上清液、在66％过饱和硫酸铵沉淀重悬后获得的上清液以及过饱和硫酸铵的上清液，将所得到的样品均稀释10倍后取10ul上清样液，然后进行sds-page电泳，最后使用考马斯亮蓝染色进行比对安排。
22、优选的，所述iptg过夜诱导的温度为24-27℃。
23、优选的，所述染色比对完成之后通过多种浓度过饱和硫酸铵进行盐沉，所述盐沉包括以下步骤：
24、s1，将15％-35％过饱和硫酸铵所得的沉淀，进行旋转离心，然后保留上清液，丢弃沉淀，并重复1—2次；
25、s2，将s1中获得的上清液先用0.45um的过滤器进行过滤，剪取蛇皮透析袋，先用过滤水浸湿，然后用透析夹关闭透析袋的一端，把蛋白样品加入透析袋，再关闭另一端，之后将装好样品的透析袋放入装有透析缓冲液的烧杯中，使透析袋完全浸没，然后把烧杯放在磁力搅拌器上搅拌4—6h后换液；
26、s3，取出透析袋，用蒸馏水冲洗后，除去夹子将透析后的蛋白倒入50ml离心管中；
27、s4，将样品加入至平衡好的琼脂糖凝胶4b中室温结合；
28、s5，取500g s4中结合后的样品，离心操作5min后留取上清液，再加入gst洗涤缓冲液洗去beads上未结合的蛋白，之后再去洗涤后的样品500g离心操作5min；
29、s6，向s5中离心的样品内加入谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温混匀20—30min，取混合样液500g，通过离心操作5min后将上清液转移至超滤管中浓缩；
30、s7，取s6中浓缩样品，加入4ml牛凝血酶切割缓冲液重悬，然后加入100u牛凝血酶，37℃过夜后切割gst标签；
31、s8，将牛凝血酶切割蛋白缓冲液加入至平衡好的琼脂糖凝胶4b中，室温20—30min下混匀，再取500g混合液，离心操作5min，取上清液至超滤管中浓缩蛋白，并进行考马斯亮蓝染色。
32、优选的，所述s2中磁力搅拌器的搅拌温度为3-7℃，所述s4中室温结合的时间为30—50min。
33、优选的，所述s4中琼脂糖凝胶4b的平衡是通过pbs清洗2-3遍去除20％酒精，然后去500g清洗后的琼脂糖凝胶4b离心操作5—8min。
34、本专利技术的技术效果和优点：
35、本专利技术先通过化学合成ha-nlec片段，并克隆至pgex-4t-1表达载体，之后转化bl21de3感受态，最后使用iptg诱导ha-nlec融合蛋白表达，在nlec的n端连接了ha标签，利用融合的gst标签进行亲和层析纯化，再经凝血酶切割获得纯化的ha-nlec重组蛋白。结果显示在蛋白纯化过程中，在亲和层析前使用15％-35％的过饱和硫酸铵可以选择性沉淀gst-ha-nlec蛋白，提高了gst亲和层析处理的效率。重要的是，添加ha标签的nlec重组蛋白保留了穿膜性和对nf-κb p65的降解能力。ha-nlec与伊马替尼联合处理能显著增强伊马替尼对ph+all细胞株sup-b15细胞的杀伤能力，有望开发为新型抗白血病重组蛋白药物。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种新型抗NF-κB重组蛋白的原核表达和抗白血病作用方法，其特征在于，所述方法先通过化学合成HA-NleC片段，并克隆至pGEX-4T-1表达载体，之后转化BL21DE3感受态，最后使用IPTG诱导HA-Nlec融合蛋白表达；
2.根据权利要求1所述的一种新型抗NF-κB重组蛋白的原核表达和抗白血病作用方法，其特征在于，所述HA-NleC片段融合蛋白表达的实验操作包括以下方法：
3.根据权利要求2所述的一种新型抗NF-κB重组蛋白的原核表达和抗白血病作用方法，其特征在于，所述第一步通过BamHI/XhoI双酶切化学合成的HA-Nlec片段之后，进行37℃酶切过夜。
4.根据权利要求2所述的一种新型抗NF-κB重组蛋白的原核表达和抗白血病作用方法，其特征在于，所述第四步热激的温度为40-45℃，所述第四步中摇床培养的温度为35-38℃，所述第四步中倒置培养的温度为36-38℃。
5.根据权利要求2所述的一种新型抗NF-κB重组蛋白的原核表达和抗白血病作用方法，其特征在于，所述第七步中使用IPTG诱导操作的温度为24-26℃。>
6.根据权利要求2所述的一种新型抗NF-κB重组蛋白的原核表达和抗白血病作用方法，其特征在于，所述第七步可溶性表达判定完整之后，继续制备100μM IPTG过夜诱导GST-HA-Nlec蛋白，过夜后冰上超声裂解，裂解完全后留样品备用；
7.根据权利要求6所述的一种新型抗NF-κB重组蛋白的原核表达和抗白血病作用方法，其特征在于，所述IPTG过夜诱导的温度为24-27℃。
8.根据权利要求6所述的一种新型抗NF-κB重组蛋白的原核表达和抗白血病作用方法，其特征在于，所述染色比对完成之后通过多种浓度过饱和硫酸铵进行盐沉，所述盐沉包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的一种新型抗NF-κB重组蛋白的原核表达和抗白血病作用方法，其特征在于，所述S2中磁力搅拌器的搅拌温度为3-7℃，所述S4中室温结合的时间为30—50min。
10.根据权利要求8所述的一种新型抗NF-κB重组蛋白的原核表达和抗白血病作用方法，其特征在于，所述S4中琼脂糖凝胶4B的平衡是通过PBS清洗2-3遍去除20％酒精，然后去500g清洗后的琼脂糖凝胶4B离心操作5—8min。
...【技术特征摘要】
1.一种新型抗nf-κb重组蛋白的原核表达和抗白血病作用方法，其特征在于，所述方法先通过化学合成ha-nlec片段，并克隆至pgex-4t-1表达载体，之后转化bl21de3感受态，最后使用iptg诱导ha-nlec融合蛋白表达；
2.根据权利要求1所述的一种新型抗nf-κb重组蛋白的原核表达和抗白血病作用方法，其特征在于，所述ha-nlec片段融合蛋白表达的实验操作包括以下方法：
3.根据权利要求2所述的一种新型抗nf-κb重组蛋白的原核表达和抗白血病作用方法，其特征在于，所述第一步通过bamhi/xhoi双酶切化学合成的ha-nlec片段之后，进行37℃酶切过夜。
4.根据权利要求2所述的一种新型抗nf-κb重组蛋白的原核表达和抗白血病作用方法，其特征在于，所述第四步热激的温度为40-45℃，所述第四步中摇床培养的温度为35-38℃，所述第四步中倒置培养的温度为36-38℃。
5.根据权利要求2所述的一种新型抗nf-κb重组蛋白的原核表达和抗白血病作用方法，其特征在于，所述第七步中使用iptg诱导操作的温度为24-26℃。
...
【专利技术属性】
技术研发人员：王聪月，徐金格，陈翀，曹旭，席静静，展佳敏，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。