２０个短串联重复序列的复合扩增试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种同时分析多个ＳＴＲ基因座的复合扩增系统，其特征在于：复合扩增２０个基因座：Ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ、ｖＷＡ、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＦＧＡ、Ｄ２Ｓ１３３８、Ｄ１９Ｓ４３３、Ｄ６Ｓ１０４３、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ３Ｓ１３５８、ＣＳＦ１ＰＯ、Ｐｅｎｔａ?Ｄ、Ｐｅｎｔａ?Ｅ、ＴＨ０１和ＴＰＯＸ。本发明专利技术还涉及同时分析ＤＮＡ样品的方法和试剂盒，以及它们的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
进一步，本专利技术涉及检测人类基因组中具有多态性的遗传标记基因。本专利技术特别涉及用聚合酶链式反应在一个扩增体系中同时扩增多个短串联重复基因座。
技术介绍
短串联重复序列(简称STR)也称为微卫星或简单序列重复(SSR)，是一类广泛存 在于真核生物基因组中的DNA串联重复序列，核心序列为2-6个碱基重复单位。STR基因 座数量大，分部广泛，约占整个基因组的3% (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001)，而且多态性高，其多态性主要源自核心序列重复次数在个体间的差异， 并且这种差异在遗传过程中遵循孟德尔遗传规律。因此，STR扩增检测技术被广泛用于个 体识别、亲缘鉴定和群体遗传学研究。目前STR复合扩增技术为法医个体识别和亲子鉴定的主要技术手段，在世界各地 的 DNA 实验室得到广泛应用(《Forensic DNA Typing))secondedition, John Butler)。在 案件分析中得到广泛应用，为案件侦破提供有力证据。随着发展，很多国家利用这一技术建 立犯罪分子及嫌疑人的DNA数据库，也就是对在押犯人和犯罪嫌疑人的DNA数据分析并录 入到数据库中，便于进行比对和排查等工作。早期的STR复合扩增技术能够实现在一个反应体系中扩增10个左右的STR基因 座，随着应用的广泛和数据比对的增加，10个基因座提供的信息不能满足要求，国内外的厂 家开发出新的更多基因座的产品，比如美国ABI公司的AmpFlSTR Identifiler试剂盒和美 国Promega公司的PowerPlex 16试剂盒都是15个STR基因座加性别决定基因。国内也 有类似的产品，比如公安部二所的DNATyperl5能够同时实现15个基因座扩增(DNATyperl5 基因座的研究与选择，叶健等，《刑事技术》，2007年03)。但是，近年来随着DNA作为鉴定手段的应用越来越广，用户对试剂盒的基因座数 量、信息含量和兼容性有了更高的要求。作为在某些遗传鉴定中，需要更多的基因座提供 更多的信息量。比如亲子鉴定、失踪人口比对时，检测的基因座数量少的话，可能发生误判 (STR基因座在二联体亲子鉴定中的应用分析，张文红等，《法医学杂志》，2008年第24卷第6 期)，往往需要17个甚至更多个基因座联合使用才能保证准确性。目前的做法通常是选择 两种厂家的复合扩增试剂盒作为补充，联合使用，达到17个STR基因座以上的效果。如果 能够实现一次反应扩增18个以上基因座，不仅可以节约试剂成本，还可以提高工作效率、 节省人力成本等。另外，在DNA数据库建设方面，对于试剂盒兼容性也提出了新的要求。我国的目前 DNA数据库中有200万份左右，我国将在DNA数据库建设方面进一步加速，到2013年DNA 数据库中的数据将超过1000万份，英国等发达国家的数据库中约有占总人口 10%的数据 (http://www. forensic, gov, uk, Asplen，2004)。随着我国DNA数据库建设规模将不断扩 大，数据比对的作用越来越重要。数据比对是建立在STR复合扩增分析得到的数据基础之上，需要各个STR试剂盒在基因座位上具有兼容性(中国法庭科学DNA数据库，《中国法医 学杂志》，姜先华，2006年第12卷第5期)。然而目前所采用的试剂盒大多以美国的CODIS 标准规定的 13 个核心基因座(vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、 FGA> D8S1179、D3S1358、CSF1P0、THOl、ΤΡ0Χ)为基础，在此基础只是选择增加其他基因座， 还有部分产品删除了 13个核心序列中的部分基因座，各厂商试剂盒基因座信息见表1。所 以，如果采用不同生产商的STR试剂盒，导入到DNA数据库中的数据是有基因座差异的。这 样在比对的时候，不是所有数据都有效，只是相同基因座部分的数据可以比对，而不同的部 分就无法应用。例如，Identifiler试剂盒和PowerPlex 16试剂盒之间相同STR基因座 为13个，其他两个STR基因座由于不同所以在数据比对时没有作用。并且，这13个可比对 基因座数据用于排除的时候是可靠的，但是用于认定的情况下往往是不够的。需要更多的 基因座数据。所以，由于各STR试剂盒基因座不同，导致了 DNA数据库部分数据资源浪费， 并且有效性不够。因此，DNA鉴定领域需要具有一个反应扩增更多基因座、能提供更多信息量和具有 更好兼容性的STR复合扩增体。表1 各主流生产商试剂盒的基因座位信息 <table>table see original document page 4</column></row><table>注黑色字体表示CODIS 13个基因座位，+表示被包括的基因座，-表示不包括的 基因座
技术实现思路
本专利技术是针对上述需求，首先建立了一次检测20个STR基因座的复合扩增体系，这些STR基因座包含了目前国内外各个生产商所采用的全部基因座位。所述的基因座为Amelogenin(AMEL)、vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、 D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、CSF1P0、 Penta D、Penta Ε、THO1、TPOX。本专利技术的扩增体系包含引物混合物、反应缓冲液和热启动Taq DNA聚合酶等。首先针对上述20个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性引物。引物设计 采用Primer 3软件，每条引物退火温度接近或高于60°C。不能产生引物二聚体、其它相互 作用或交叉反应，扩增产物长度在90-450bp之间。对每对引物进行扩增测试并优化，直至 得到清晰单一扩增条带。引物序列见下表2。表2复合扩增体系各基因座引物序列<table>table see original document page 5</column></row><table><table>table see original document page 6</column></row><table>根据扩增片段长度等将上述基因座分为4组，第一组包含D19S433、D5S818、 D21S11、D18S51 和 D6S1043,第二 组包含 D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSFlPO 和 PentaD，第三组包含 Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX 和 Penta E，第四组包含 TH01、 D12S391、D2S1338和FGA。每组分别由不同荧光素标记，每组之中各基因座扩增产物根据长 度差异分开，两个基因座不能有重叠。分别对每组引物进行复合扩增试验。确定该组没有 非特异扩增现象，无交叉反应等情况后，调整每对引物的浓度，使组内各个片段峰值均衡性 达到40%以上。将4组引物分别用蓝色、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时分析多个ＳＴＲ基因座的复合扩增系统，其特征在于：复合扩增２０个基因座：Ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ、ｖＷＡ、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＦＧＡ、Ｄ２Ｓ１３３８、Ｄ１９Ｓ４３３、Ｄ６Ｓ１０４３、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ３Ｓ１３５８、ＣＳＦ１ＰＯ、Ｐｅｎｔａ　Ｄ、Ｐｅｎｔａ　Ｅ、ＴＨ０１和ＴＰＯＸ。

【技术特征摘要】
一种同时分析多个STR基因座的复合扩增系统，其特征在于复合扩增20个基因座Amelogenin、vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、Penta D、Penta E、TH01和TPOX。2.根据权利要求1所述的复合扩增系统，其中所述的基因座分为下述组合D19S433、 D5S818、D21S11、D18S51 和 D6S1043 ；D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1P0 和 PentaD ； Amelogenin、vWA、D8S1179、TP0X 和 Penta E ；TH01、D12S391、D2S1338 和 FGA。3.根据权利要求1或2所述的复合扩增系统，其中在一个复合扩增反应体系中同时扩 增20个基因座。4.根据权利要求2所述的复合扩增系统，其中基因座被位于该基因座两侧的一对引物 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：高阳，陈初光，马斌，王曙光，
申请(专利权)人：基点认知技术北京有限公司，鼎生科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]