【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物，具体是涉及一种用于检测食品中曼氏迭宫绦虫裂头蚴lamp恒温扩增方法。
技术介绍
1、曼氏迭宫绦虫(spirometra mansoni)属于双叶槽科迭宫属，能影响人体中枢神经系统的寄生虫，是一种重要的食源性人兽共患病寄生虫。曼氏迭宫绦虫第一中间宿主是剑水蚤，中间宿主是青蛙、蝌蚪、蛇，终宿主主要是犬类和猫类，人可作为中间宿主、转宿宿主和终宿主。成虫寄生于人、猫和狗等食肉动物的小肠中，感染时伴随有腹痛、恶心呕吐等轻微症状，中期裂头蚴感染人类导致的危害程度更大，主要是曼氏迭宫绦虫裂头蚴有很强的体内移行能力，可移行至皮下、内脏、眼部、脑部等重要部位，裂头蚴寄生于眼部能影响视力甚至导致失明；寄生于脑部能够导致抽搐昏迷、瘫痪甚至死亡。人感染曼氏迭宫绦虫裂头蚴最主要的途径是食用含有裂头蚴的生的或半生的青蛙肉或蛇肉，以及饮用含有原尾蚴的剑水蚤的水。曼氏迭宫绦虫裂头蚴病流行区域非常广泛，在亚洲、非洲、美洲及欧洲都有发现,据不完全统计，全球有2000多例病例报道。
2、目前对曼氏迭宫绦虫裂头蚴的检测主要采用形态学检测和常规pcr方法，例如国标方法(gb 61610.6-2023)检测包括形态学解剖、镜检，确定可疑虫体后则进行dna提取，常规pcr扩增、电泳、阳性结果需进行基因测序，序列比对，检测操作步骤繁琐、耗费时间长，检测效率低，且对实验室的仪器设备要求较高，需要配备pcr扩增仪、凝胶成像系统、电泳仪等。lamp检测技术，全称为环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermalamplific
3、因此非常有必要建立一套特异性好、灵敏度高的食品中曼氏迭宫绦虫裂头蚴lamp恒温扩增方法，应用于食品安全监督检验、保障性检验及突发食品安全事件应急检验等领域。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提出一种曼氏迭宫绦虫裂头蚴lamp恒温快速检测方法，其对曼氏迭宫绦虫裂头蚴特异性好、灵敏度高，可用于食品中曼氏迭宫绦虫裂头蚴的快速检测。
2、本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：
3、曼氏迭宫绦虫裂头蚴lamp恒温快速检测方法，其包括有以下步骤：
4、步骤1、准备待测dna样品，以及准备对待测dna样品进行lamp恒温扩增的lamp恒温扩增特异性引物；
5、所述待测dna样品经超微量分光光度计测定后，其a260/a280在1.7-2.0之间，dna浓度＞10ng/μl，于-20℃保存备用；
6、所述lamp恒温扩增特异性引物是选取曼氏迭宫绦虫裂头蚴特异性基因序列进行合成得到，所述曼氏迭宫绦虫裂头蚴基因采用：曼氏迭宫绦虫(spirometra mansoni)gst基因(登录号：on 527164.1)；所述特异性基因序列在曼氏迭宫绦虫裂头蚴gst基因中第191bp-405bp位置。
7、所述lamp恒温扩增特异性引物为：
8、外引物f3：5’-gggaaaagcatggtcttgga-3’
9、外引物b3：5’-gttgtcacccattagccact-3’
10、内引物fib：
11、5’-cggcttagaccagttcgcaagtgcaaaggaacaggctgagat-3’
12、内引物bip：
13、5’-acaaagaagagcggcctagctttcgccgaggtaattggaaat-3’
14、环引物lf：5’-gcagcctctgccatagca-3’
15、环引物lb：5’-atgcccacatttgaaaagggcattg-3’
16、步骤2、采用lamp恒温扩增反应体系，对待测dna样品进行lamp恒温扩增，检测扩增产物的荧光信号，得到检测结果；其中，所述lamp恒温扩增反应体系包括有所述lamp恒温扩增特异性引物。
17、优化方案，本专利技术的lamp恒温扩增反应体系为25μl，包括有内引物fib(200μmol/l)和内引物bip(200μmol/l)各0.2μl，外引物f3(100μmol/l)和外引物b3(100μmol/l)各0.05μl，环引物lf(200μmol/l)和环引物lb(200μmol/l)各0.1μl；其余试剂组分分别为：10×thermo pol buffer 2.5μl，mgso4(100mmol/l)2μl，dntps(10mmol/l)3.5μl，甜菜碱(5mol/l)6μl，bst酶(8u/μl)1μl，syto-9染料(20μmol/l)0.5μl，dna模板2μl，ddh2o 6.8μl。
18、优化方案，本专利技术的lamp恒温扩增反应体系中，采用恒温扩增仪的lamp恒温扩增条件为：扩增温度是63℃，进行45个循环，每个循环的扩增时间是60s；采用实时荧光pcr仪的扩增条件为：第一步63℃条件下扩增30s，1个循环，不采集荧光信号；第二步63℃条件下扩增15s，45个循环，不采集荧光信号；第三步63℃条件下扩增45s，45个循环，采集荧光信号。
19、本专利技术具有以下突出的实质性特点和显著的进步：
20、1、本专利技术提供了一种用于曼氏迭宫绦虫裂头蚴鉴定的特异性基因序列，该序列具有很高的特异性，可以用于曼氏迭宫绦虫裂头蚴的定性检测，具有商业化开发价值。申请人用该特异性基因序列设计的lamp恒温扩增特异性引物及lamp恒温扩增反应体系对12种非靶标虫体进行特异性检测，结果显示本专利技术对曼氏迭宫绦虫裂头蚴dna样品扩增阳性，而对其他非靶标虫体dna样品均扩增阴性，说明该特异性基因序列具有很高的特异性，可以作为曼氏迭宫绦虫裂头蚴定性检测的特异性标志物。另外，申请人还对本专利技术进行了灵敏度及稳定性检测，结果说明本专利技术的方法具有灵敏度高和稳定性好的特点。
21、2、本专利技术提供了一种可特异性鉴定曼氏迭宫绦虫裂头蚴的lamp恒温扩增特异性引物，其特异性好，对曼氏迭宫绦虫裂头蚴可实现特异性检测，而对其他寄生虫则不能特异性扩增；此外，专利技术曼氏迭宫绦虫裂头蚴lamp检测体系，该检测体系能1小时内实现曼氏迭宫绦虫裂头蚴的快速检测，具有检测高效快速简便的特点。
22、3、本专利技术利用所述的lamp恒温扩增特异性引物可快速、高通量地检测食品中是否存在曼氏迭宫绦虫裂头蚴，且方法检测成本低，不依赖大型贵重检测仪器，操作简单，效率高，对检验人员要求不高，适用于实验条件匮乏广大基层及现场保障的快速检测。
23、4、本专利技术实现了食品中曼氏迭宫绦虫裂头蚴lamp快速检测方法，该技术可以大量推广应用，将在食源性寄生虫检测本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.曼氏迭宫绦虫裂头蚴LAMP恒温快速检测方法，其特征在于包括有以下步骤：
2.根据权利要求1所述的曼氏迭宫绦虫裂头蚴LAMP恒温快速检测方法，其特征在于：所述LAMP恒温扩增反应体系为25 μL，包括有内引物FIB 200 μmol/L 和内引物BIP 200 μmol/L、各0.2 μL，外引物F3 100 μmol/L 和外引物B3 100 μmol/L、各0.05 μL，环引物LF200 μmol/L 和环引物LB 200 μmol/L、各0.1 μL；其余试剂组分分别为：10× Thermo polBuffer 2.5 μL，MgSO4 100 mmol/L 2 μL，dNTPs 10mmol/L 3.5 μL，甜菜碱 5 mol/L 6 μL，Bst 酶 8 U/μL 1 μL，SYTO-9染料 20μmol/L 0.5 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 6.8 μL。
3.根据权利要求2所述的曼氏迭宫绦虫裂头蚴LAMP恒温快速检测方法，其特征在于：所述LAMP恒温扩增反应体系中，采用恒温扩增仪的LAMP恒温扩增条件为：扩增温度是63 ℃
...【技术特征摘要】
1.曼氏迭宫绦虫裂头蚴lamp恒温快速检测方法，其特征在于包括有以下步骤：
2.根据权利要求1所述的曼氏迭宫绦虫裂头蚴lamp恒温快速检测方法，其特征在于：所述lamp恒温扩增反应体系为25 μl，包括有内引物fib 200 μmol/l 和内引物bip 200 μmol/l、各0.2 μl，外引物f3 100 μmol/l 和外引物b3 100 μmol/l、各0.05 μl，环引物lf200 μmol/l 和环引物lb 200 μmol/l、各0.1 μl；其余试剂组分分别为：10× thermo polbuffer 2.5 μl，mgso4 100 mmol/l 2 μl，dntps 10mmol/l 3...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁美丹，雷燕，胡凌，黄志深，林秀敏，王亚琦，蒋佳希，陈楷，黄松，郑洁玲，
申请(专利权)人：广州市食品检验所广州市酒类检测中心，
类型：发明
国别省市：
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