【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于荧光素碳点染色液，具体涉及一种用于真菌检测的免清洗双色细胞成像荧光素碳点染色液及染色方法和应用。
技术介绍
1、表皮真菌的检测对于皮肤、毛发的疾病诊断和预防有着重要的指导作用。传统的表皮真菌检测方法主要是真菌涂片镜检和真菌培养。涂片镜检是将所取标本直接置于玻片上，用染色或加10％koh溶液，在光镜下检查，但是真菌与组织细胞之间的反差不大，鉴别真菌非常困难，很大程度需要依赖操作人员的经验来解释结果，有很大的可能性会造成误检。真菌培养是浅部真菌感染判断的金标准，但由于病原菌的复杂性，所耗费的时间较长，在实际的日常工作中难以满足临床要求。
2、近年来，真菌荧光染色法作为传统真菌镜检法改良技术，因其快速灵敏并且特异性高，在临床上得到了越来越广泛的关注，真菌荧光染色法通过使用荧光染料，在荧光显微镜特定的激发光波段照射下，荧光染料靶向的真菌可与黑暗背景形成显著反差，使得真菌在显微镜下形态结构清晰可见，易于观察，大大提高了工作效率和临床真菌检测的灵敏度。目前市面上用于表皮真菌检测中的荧光试剂配方复杂，配制繁琐，性能不稳定。荧光试剂一般包括三种主要成分，荧光增白剂、氢氧化钾和背景复染剂：1)荧光增白剂与组织中β-多糖成分相结合，产生荧光；2)氢氧化钾能溶解样品组织中的角质、消除杂质，并使组织透明；3)背景复染剂能降低样品组织的背景亮度，使荧光信号更加清晰。然而，由于荧光增白剂在强碱环境中稳定性差，荧光素会发生析出沉淀现象；而且背景复染剂也会影响荧光增白剂的稳定性，会引起检测灵敏度的降低；且染色步骤繁琐，无法达到临床对真
3、碳点是指至少某一维度的尺寸大小在10nm范围内的零维碳基纳米颗粒，近几年由于其优越生物相容性和光致发光性等特性，被广泛应用于化学传感、药物递送、光催化剂和食品检测等领域而备受关注。生物成像也是其应用最广泛的一个领域，经实验验证通过在碳核表面修饰多种亲和基团来靶向微生物的策略能有效满足临床对微生物的快速筛查的要求。
4、现有技术之一中的荧光染色剂，涉及检测真菌和皮肤寄生虫，成分复杂，由水、荧光增白剂、氢氧化钾、背景复染剂、促溶剂和保湿剂组成。
5、其存在以下缺点：1)成分复杂，一般需要加入背景复染剂来降低样品组织的背景亮度，需要碱溶解样品组织中的角质、消除杂质，从而使荧光信号更加清晰，但是这些溶剂会影响荧光增白剂的稳定性，导致性能不稳定，又需要其他试剂维持稳定，导致溶液配制繁琐；2)染色后，真菌在荧光显微镜下呈蓝色荧光，伤眼；3)荧光增白剂、碱等的生物相容性较差，有一定的生物毒性。
6、现有技术之二的荧光染色液，成分包括包括入麦胚素、异硫氰酸荧光素、碘化丙啶、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、丙三醇、proclin 300和水，作用为能结合形态学实现对阴道分泌物样本、宫颈脱落细胞样本、皮肤样本以及痰液样本中微生物的检测。
7、其存在以下缺点：1)该染色液是利用凝集素对糖蛋白的特异性识别和核酸染料对核酸的特异性染色，成本高；2)成分复杂，配制繁琐，荧光素性能不稳定；3)对制片要求高，步骤繁琐。
8、现有技术之三的荧光染色液同样含有荧光素碳点材料，原料为荧光增白剂33、柠檬酸、乙二胺，其存在以下缺点：能对实验室培养的真菌进行观察，但未涉及在不能消除杂质如皮屑的影响对真菌的检测，不能满足临床快速筛查的要求。
技术实现思路
1、为了解决目前的荧光染色液成分复杂，性能不稳定，发光单一的问题，本专利技术的第一个目的在于提供一种用于真菌尤其是表皮真菌检测的免清洗双色细胞成像荧光素碳点染色液，该染色液只含有荧光素碳点和水，成分简单，性能稳定，可以双色成像，且可以使待测样品免清洗，且在荧光显微镜下长时间不猝灭。
2、本专利技术的目的还在于提供采用上述染色液进行真菌尤其是表皮真菌染色的方法，该方法简单易行，耗时短，且该染色液对菌靶向能力好，能通过形态学明显区分皮屑和菌，成片质量高。
3、本专利技术的最后一个目的在于提供上述荧光素碳点染色液在采用荧光染色法进行真菌尤其是表皮真菌检测中的应用。
4、本专利技术的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种用于真菌检测的双色细胞成像荧光素碳点染色液，以质量百分含量计，包括：荧光素碳点材料0.50％～1.50％、水98.50％～99.50％；其中所述荧光素碳点材料由以下质量百分含量的原料制成：荧光增白剂135#0.5％～1.3％、乙二胺25％～29％、过硫酸铵0.05％～0.13％、水69.57％～74.45％。
5、荧光增白剂135#是一种在激发光的照射下发蓝光，微溶于水的荧光素，在镜检时，为了更好的成像，往往搭配强碱用以溶解组织，然而碱的加入会极大影响荧光增白剂的稳定性，导致性能不稳定。因此本申请中先使用荧光增白剂135#、乙二胺、过硫酸铵、水为原料一步水热碳化形成的碳点，其中具有较好还原型的乙二胺帮助碳点成核，过硫酸铵具有的氧化性进一步提高了碳点的光学性能，荧光增白剂135#分子结构更小，更易成核，因而制成了水溶性良好且稳定、发黄光，能强力靶向真菌的荧光素碳点材料。
6、本专利技术荧光素碳点材料的制备原料有：乙二胺、荧光增白剂135#、过硫酸铵和水。
7、本专利技术所述荧光素碳点材料优选通过以下方法制备获得：选取荧光增白剂135#、过硫酸铵、乙二胺和水，采用水热法一步反应制备而成，反应产物经过滤得到荧光素碳点材料。
8、优选地，所述荧光素碳点材料采用水热法一步反应制得，包括在温度为120～180℃条件下进行水热反应8～12小时。
9、更佳地，所述荧光素碳点材料采用水热法一步反应制得，包括在温度为140℃的烘箱中进行水热反应10小时。
10、本专利技术的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：采用上述荧光素碳点染色液进行真菌染色的方法，包括以下步骤：
11、1)制片：取洁净载玻片，在中间区域滴水，并将待测样本移至水滴处，加热烘干，制片完成；
12、2)染色：将荧光素碳点染色液滴加到待测样本上进行覆盖并染色2min～10min，风干；
13、3)封片：取盖玻片直接加盖染色完成的载玻片；
14、4)镜检：取样片载玻片于荧光显微镜下uv光和蓝光波段进行观测，查看待测样本中真菌的形态及荧光强度。
15、优选地，步骤4)中在320～400nm波段的紫外光下进行观测，待测样本在紫外激发下呈现青色荧光，在400～470nm波段的蓝光下进行观测，待测样本在蓝光激发下呈现明亮黄色荧光。
16、更佳地，步骤4)中在365nm波段的紫外光下进行观测，待测样本在紫外激发下呈现青色荧光，在455nm波段的蓝光下进行观测，待测样本在蓝光激发下呈现明亮黄色荧光。
17、本专利技术的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：上述荧光素碳点染色液在采用荧光染色本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于真菌检测的免清洗双色细胞成像荧光素碳点染色液，其特征在于：以质量百分含量计，包括：荧光素碳点材料0.50％～1.50％、水98.50％～99.50％；其中所述荧光素碳点材料由以下质量百分含量的原料制成：荧光增白剂135#0.5％～1.3％、乙二胺25％～29％、过硫酸铵0.05％～0.13％、水69.57％～74.45％。
2.根据权利要求1所述的用于真菌检测的免清洗双色细胞成像荧光素碳点染色液，其特征在于：以质量百分含量计，包括：荧光素碳点材料1.00％、水99.00％；其中所述荧光素碳点材料由以下质量百分含量的原料制成：荧光增白剂135#0.9％，乙二胺27％、过硫酸铵0.09％、水72.01％。
3.根据权利要求1所述的用于真菌检测的免清洗双色细胞成像荧光素碳点染色液，其特征在于：所述荧光素碳点材料采用水热法一步反应制得，包括在温度为120～180℃条件下进行水热反应8～12小时。
4.根据权利要求3所述的用于真菌检测的免清洗双色细胞成像荧光素碳点染色液，其特征在于：所述荧光素碳点材料采用水热法一步反应制得，包括在温度为140
5.采用权利要求1-4任一项所述荧光素碳点染色液进行真菌染色的方法，其特征在在于包括以下步骤：
6.权利要求1-4任一项所述荧光素碳点染色液在采用荧光染色法进行真菌检测中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于真菌检测的免清洗双色细胞成像荧光素碳点染色液，其特征在于：以质量百分含量计，包括：荧光素碳点材料0.50％～1.50％、水98.50％～99.50％；其中所述荧光素碳点材料由以下质量百分含量的原料制成：荧光增白剂135#0.5％～1.3％、乙二胺25％～29％、过硫酸铵0.05％～0.13％、水69.57％～74.45％。
2.根据权利要求1所述的用于真菌检测的免清洗双色细胞成像荧光素碳点染色液，其特征在于：以质量百分含量计，包括：荧光素碳点材料1.00％、水99.00％；其中所述荧光素碳点材料由以下质量百分含量的原料制成：荧光增白剂135#0.9％，乙二胺27％、过硫酸铵0.09％、...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶丙刚，李贞臻，崔丽净，
申请(专利权)人：广东食品药品职业学院，
类型：发明
国别省市：
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