【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，属于ipc分类号a61k，具体涉及一种药物组合物及应用，尤其涉及针对原发性肝癌细胞表面tnfrsf10b/asgr1的双靶点的第三代嵌合抗原受体t细胞（car-t）的构建方法及与扶正解毒消积方（fzjd）联用后提高治疗原发性肝癌疗效的应用。
技术介绍
1、肝癌，即肝脏恶性肿瘤，是全球第六大常见癌症，也是癌症相关死亡的第四大原因，其5年生存率为18%。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，hcc）占90%，属于原发性肝癌，是一种起源于肝细胞的恶性肿瘤。肝癌的传统治疗方式包括手术、经导管动脉化疗栓塞、局部消融、靶向治疗等，但这些方式的疗效提升有限，因此，肿瘤免疫联合疗法的重要性日渐凸显。
2、cd8+t细胞分化而来的效应性t细胞可以选择性杀死肿瘤细胞。维持或恢复效应t细胞的活性是肿瘤免疫治疗的关键环节。目前临床上应用广泛的pd-1/pd-l1等免疫检查点抑制剂（icis）可以部分恢复效应t细胞的抗肿瘤活性，但肿瘤内部的慢性炎症的刺激及免疫抑制环境会诱导效应t细胞成为低反应性t细胞，其会丧失活性并逐渐耗竭。同时，大约30%左右的肝癌组织内部缺乏t细胞及炎细胞等浸润，故icis的抗原靶点表达低，对其先天耐药。总之，目前icis在肝癌的疗效尚不够令人满意。
3、嵌合抗原受体t细胞免疫疗法（chimeric antigen receptor t-cellimmunotherapy，简称为“car-t细胞疗法”）作为肿瘤免疫治疗的新兴手段之一，是目前肿瘤治疗研究领域的焦点。
4、多个多中心临床试验通过运用靶向于cd19、cd20或cd30的car-t细胞治疗了包括b细胞急性淋巴细胞白血病（b-all）、b细胞非霍奇金淋巴瘤（b-nhl）、慢性淋巴细胞白血病（cll）以及霍奇金淋巴瘤（hl）在内的多种b细胞肿瘤。在实体肿瘤的治疗中，也有多种靶向肿瘤细胞表面相关抗原的car疗法进入了1~2期临床试验，如靶向卵巢癌、间皮瘤、胰腺癌表达的间皮素（msln），靶向神经母细胞瘤表达的表皮生长因子ⅲ型突变体（egfr viii）、靶向大肠癌和乳腺癌表达的人表皮生长因子受体2（her2）、癌胚抗原（cea）以及靶向前列腺癌的前列腺特异性膜抗原（psma）的car-t疗法等。car-t细胞治疗后复发的主要机制在于car-t细胞的有限持久性、car-t细胞功能抑制和抗原逃逸，为了最大限度地减少因靶点逃逸而复发的风险，临床试验中正积极探索双靶点car-t识别一种以上肿瘤相关抗原的策略。在血液系统恶性肿瘤的临床前模型和临床试验中，双靶点car-t细胞治疗的抗原至少有三种组合：cd19/cd20、cd19/cd22以及bcma/cd38。在肝癌中，已有以去唾液酸糖蛋白受体1（asialoglycoprotein receptor 1，asgr1）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，gpc3）为靶点的car-t正在研发。“脱靶效应”为car-t应用中面临的广泛难题，在实体瘤中，car-t细胞对表达靶抗原的非肿瘤组织的识别，往往导致临床严重的非肿瘤靶向毒性。现有的gpc3单靶点car-t对肝癌识别的灵敏度和特异性不高，gpc3单靶点car-t在临床应用中出现了级别较高的细胞因子释放综合征（5级），其安全性需进一步提升。目前也有gpc3双靶点car-t疗法，但是其杀伤效果较gpc3单靶点car-t未得到显著提升。
5、此外，一方面由于对本领域技术人员的理解存在差异；另一方面由于申请人做出本专利技术时研究了大量文献和专利，但篇幅所限并未详细罗列所有的细节与内容，然而这绝非本专利技术不具备这些现有技术的特征，相反本专利技术已经具备现有技术的所有特征，而且申请人保留在
技术介绍
中增加相关现有技术之权利。
技术实现思路
1、多个肿瘤相关信号转导通路异常激活会引起肿瘤的恶性进展，信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，stat3）通路是其中较为重要的通路之一。stat3是肿瘤微环境中调控多种炎症因子、细胞因子和生长因子发挥作用的关键信号分子，其通过将细胞外信号转导至细胞核而直接参与下游功能基因调控。多个证据表明，stat3不仅存在于癌细胞中，而且在微环境内的多种免疫细胞和成纤维细胞中都会被过度激活。stat3经激活后可发生磷酸化，成为p-stat3，经二聚体化后进入细胞核内与dna应答元件结合，调节胞内多个基因的转录和活性，促进肿瘤细胞的增殖、血管形成并抑制肿瘤细胞凋亡，因此，stat3的异常激活促进了肝癌的进展。
2、血液系统肿瘤及胶质瘤的靶点具有较好的特异性，但肝癌细胞表面可作为car-t识别靶点的抗原种类较少，如肝癌患者的组织中，gpc3阳性率约60%，意味着40%左右的患者的肝癌细胞无法被以gpc3为靶点的car-t识别，因此，亟需开发其他靶向性、灵敏度和特异性更强的car-t。肝癌治疗中，car-t向肿瘤的特异性趋化能力差、向实体瘤内部浸润能力不强、肿瘤内部持续的炎症环境及肝癌细胞pd-l1高表达所诱导的t细胞耗竭等缺陷影响其细胞毒性的发挥。另一方面，大多表达在肝癌细胞表面的肿瘤相关抗原为非肿瘤特异性抗原，其能够表达于其他正常组织，因而导致正常组织易于遭受car-t细胞的攻击，形成以白介素6（il-6）升高为主的系统性“细胞因子风暴”，有发展为多器官衰竭和死亡的风险。
3、gpc3是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的成员，在hcc中高表达，而在正常肝组织中不表达或低表达。有研究证实，gpc3的表达与hcc的进展相关，约60-70%的hcc患者表达gpc3，53%的hcc患者血清gpc3表达水平显著升高。现有技术公开了gpc3单靶点car-t及gpc3/asgr1双靶点car-t治疗肝癌的技术方案。通过对临床样本免疫组化结果显示，所检测的75例肝细胞肝癌样本中，有50例gpc3表达阳性，阳性率为66.7%；而asgr1在所有的正常肝组织中均有较高水平的表达（90.7%）。经统计，在75例肝癌组织样本中，共有41例（54.7%）同时有gpc3和asgr1的共表达；目前研究人员已进行了两项连续的gpc3单靶点car-t疗法在hcc本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种药物组合物，其特征在于，包括TNFRSF10B/ASGR1双靶点嵌合抗原受体T细胞和扶正解毒消积方，其中，双靶点嵌合抗原受体T细胞膜表面表达TNFRSF10B/ASGR1双靶点嵌合抗原受体。
2.如权利要求1所述的药物组合物于预防和/或治疗肿瘤中的应用。
3.如权利要求1所述的药物组合物于提高肝癌治疗效果中的应用。
4.一种双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，包括信号肽、靶向TNFRSF10B的第一抗原结合区、靶向ASGR1的第二抗原结合区、铰链区、跨膜区以及胞内区。
5.根据权利要求4所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，靶向TNFRSF10B的第一抗原结合区包括抗TNFRSF10B抗体轻链可变区和抗TNFRSF10B抗体重链可变区，其中，抗TNFRSF10B抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，抗TNFRSF10B抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
6.根据权利要求4或5所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，靶向ASGR1的第二抗原结合区包括抗ASGR1抗体重链可变区，其中
7.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求4~6之一所述的双靶点嵌合抗原受体。
8.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求7所述的核酸分子。
9.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求8所述的载体或染色体中整合有外源的如权利要求7所述的核酸分子或表达如权利要求4~6之一所述的双靶点嵌合抗原受体。
10.如权利要求4~6之一所述的双靶点嵌合抗原受体、如权利要求7所述的核酸分子、如权利要求8所述的载体和如权利要求9所述的宿主细胞在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种药物组合物，其特征在于，包括tnfrsf10b/asgr1双靶点嵌合抗原受体t细胞和扶正解毒消积方，其中，双靶点嵌合抗原受体t细胞膜表面表达tnfrsf10b/asgr1双靶点嵌合抗原受体。
2.如权利要求1所述的药物组合物于预防和/或治疗肿瘤中的应用。
3.如权利要求1所述的药物组合物于提高肝癌治疗效果中的应用。
4.一种双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，包括信号肽、靶向tnfrsf10b的第一抗原结合区、靶向asgr1的第二抗原结合区、铰链区、跨膜区以及胞内区。
5.根据权利要求4所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，靶向tnfrsf10b的第一抗原结合区包括抗tnfrsf10b抗体轻链可变区和抗tnfrsf10b抗体重链可变区，其中，抗tnfrsf10b抗体轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：1所示，抗tnfrsf10b抗体重链可...
【专利技术属性】
技术研发人员：王宪波，冯颖，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京地坛医院，
类型：发明
国别省市：
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