本发明专利技术涉及外泌体提取技术领域，具体涉及一种细胞培养基提取外泌体的方法，包括以下步骤：S1.将细胞培养基溶液进行预处理得到含外泌体的细胞培养液；S2.将所述含外泌体的细胞培养液进行初滤；S3.初滤后的过滤液放入到分子量5K~50K的透析袋进行透析浓缩，将初滤后的过滤液浓缩到原有体积1~10%，得到浓缩后的滤液；S4.将浓缩后的滤液放入到截留分子量100K~800K透析袋中进行二次透析，透析到透析液中检测不到蛋白质；S5.收集二次透析后的滤过液。本发明专利技术收集的外泌体采用透析袋过滤系统，可以确保提取的外泌体为纳米级；过程中不使用到昂贵的设备或是试剂，提取出来的细胞培养基外泌体内含丰富的活性物质，减少了高速的机械损伤，分离效率高，成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及外泌体提取，具体涉及一种细胞培养基提取外泌体的方法。
技术介绍
1、目前，细胞培养基外泌体的常见的分离提取方法主要有：超速离心、免疫磁珠、超滤法或尺寸色层分析法等方法。超速离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但须需购买价格高昂的低温超速离心机，且回收率不稳定；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是磁珠价格贵，每次作用的体积小效率不高，进行大批量生产困难度高，不利生产。利用peg沉淀外泌体存在不少问题：比如纯度和回收率低，杂蛋白较多，以及于人体使用时要将peg去除干净不易等问题。
2、近几年来，出现各种商业化的外泌体提取试剂盒，有的是通过特殊设计的过滤器过滤掉杂质成分，有的则采用空间排阻色谱法(sec)进行分离纯化，也有的则利用化合物沉淀将法外泌体沉淀出来。但购买这些商用试剂盒仍面临成本高，无法大量提取的问题。现有技术中的这些方案对于从大量的细胞培养基中提取外泌体都面临需要购买贵重的高速离心设备或是滤膜管柱，成本较高。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种细胞培养基提取外泌体的方法，解决现有技术中对于从大量的细胞培养基中提取外泌体都面临需要购买贵重的高速离心设备或是滤膜管柱，成本较高的技术问题。
2、本专利技术公开了一种细胞培养基提取外泌体的方法，包括以下步骤：
3、s1.将细胞培养基溶液进行预处理得到含外泌体的细胞培养液；
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p>4、s2.将所述含外泌体的细胞培养液进行初滤；5、s3.初滤后的过滤液放入到分子量5k~50k的透析袋进行透析浓缩，将初滤后的过滤液浓缩到原有体积1~10%，得到浓缩后的滤液；
6、s4.将浓缩后的滤液放入到截留分子量100k~800k透析袋中进行二次透析，透析到透析液中检测不到蛋白质；
7、s5.收集二次透析后的浓缩液。
8、进一步的，所述步骤s1中预处理为将细胞或是破碎的细胞器进行初步移除。
9、进一步的，所述步骤s1中预处理具体为取细胞培养基溶液200-1000g，低速离心5-50min，取上清液。
10、进一步的，所述上清液为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、牙髓干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、毛囊干细胞、皮肤干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞或上述干细胞所诱导分化细胞的细胞培养上清液。
11、进一步的，所述步骤s2中初滤为过0.22-0.45μm滤膜过滤除菌。
12、进一步的，所述步骤s3中透析袋外面的透析液为高渗透压高分子溶液。
13、进一步的，所述高渗透压高分子溶液为聚乙二醇， 丙烯酸，丙醯胺（ch3conh2）、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯或甲基纤维素，所述高渗透压高分子溶液的分子量为1~4k，其溶于生理盐水后质量浓度为50％－80％。
14、进一步的，所述步骤s3中透析时间为12-24小时透析，过程中置换透析液3~5次。
15、进一步的，所述步骤s4中二次透析的透析液为0.9%的生理食盐水，所述0.9%的生理食盐水溶有15-50万分子量的聚乙二醇， 丙烯酸，丙醯胺（ch3conh2）、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯或甲基纤维素的溶液，所述聚乙二醇， 丙烯酸，丙醯胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯或甲基纤维素的浓度为10%-20%（溶于生理食盐水后）。用来进行去盐类及蛋白质。
16、使用透析袋(100k~800k)及透析液的组成包含高分子的分子量(15-50万分子量)及浓度(5-10%)，可以有效地进行捉捕游离的水溶性蛋白质而提高外泌体的纯度，其作用原理如下
17、(a)添加高浓度且分子链上带有高负电聚乙二醇，透明质酸或甲基纤维素…等，水溶性的高分子聚合物可以用来沉淀蛋白质，其作用原理类似有机溶液，但可使用低浓度。亲水性高分子尾端充满负电，可迅速捕捉水溶液中的蛋白质氨基产生的正电，从而形成蛋白质-聚电解质沉淀；这种方式不会破坏外泌体结构，加上有透析袋的防护也避免高分子和外泌体混合，后续还需进行分离的情况；
18、(b)这种方式可将培养液中的蛋白质片段分开：包含蛋白质聚集体、蛋白质碎片、细胞蛋白质、dna…等这种方式不会破坏外泌体结构，加上有透析袋的防护也避免高分子和外泌体混合，后续还需进行分离的情况。
19、进一步的，所述步骤s4中二次透析的时间为12-24小时，浓缩后的滤液体积会随透析过程自动增加，体积变为110~200%，过程中置换透析液3~5次。
20、一种外泌体，使用上述方法得到。
21、一种外泌体的应用，用于制备消炎及抗敏祛红，促进伤口愈合的外泌体液体敷料，缓解哮喘及急性呼吸窘迫症的外泌体喷雾。
22、与现有技术相比，本专利技术具有的有益效果是：
23、1.本专利技术收集的外泌体采用透析袋过滤系统，可以确保提取的外泌体为纳米级；过程中不使用到昂贵的设备或是试剂，提取出来的细胞培养基外泌体内含丰富的活性物质，减少了高速的机械损伤，分离效率高，成本低；
24、2.本专利技术的提取方法是将透析袋过滤基础上，对透析流程及透析液进行了优化，不使用有毒或难以移除试剂，不破坏外泌体结构也可与蛋白质分好分离相较于传统的离心方法，得出了一种适合大规模分离提取间充质干细胞外泌体提取方法，该方法提取的外泌体不仅纯度高，获取的外泌体蛋白总量也高，内含活性物质丰富，还具有特异性标志物评估间充质干细胞的外泌体的质量和潜在的疗效；
25、3.本专利技术可取得高浓度的外泌体，避免在离心过程会造成外泌体的破裂及再融合的现象，可以最大维持外泌体内部的活性物质以及维持粒径，避免高速离心造成外泌体破裂或是再融和的现象；
26、4.本专利技术在进行浓缩的过程所使用5k~50k的透析袋能有效保留外泌体在透析膜内，并截留外部的高分子(分子量1k~4k)采用这种范围分子量的亲水性高分子，容易配置高浓度透析液，达到快速脱水浓缩，增加浓缩的效率，这样的分子量的高分子也不容易通过透析膜进入袋内，避免后续需在进行高分子以外泌体进行二次分离的步骤﹔整个过程不使用机械力，再浓缩的过程非常温和，也减低损耗，以及避免外泌体破裂以及浓缩过程高温产生导致外泌体内的细胞因子或是dna，rna产生破坏；
27、5.本专利技术的步骤s3与步骤s4顺序进行可得到最好的提取效果，如果进行调换，外泌体的提取时间将会加长，进而影响外泌体的活性或是使蛋白容易沉积在外泌体的表面，依据此顺序可以有效地进行浓缩以及捉捕游离的水溶性蛋白质而提高外泌体的纯度及浓度，且不会破坏外泌体表面结构或使其失去活性。
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【技术保护点】
1.一种细胞培养基提取外泌体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种细胞培养基提取外泌体的方法，其特征在于：所述步骤S1中预处理为将细胞或是破碎的细胞器进行初步移除。
3.根据权利要求1所述的一种细胞培养基提取外泌体的方法，其特征在于：所述步骤S2中初滤为过0.22-0.45μm滤膜过滤除菌。
4.根据权利要求1所述的一种细胞培养基提取外泌体的方法，其特征在于：所述步骤S3中透析袋外面的透析液为高渗透压高分子溶液。
5.根据权利要求4所述的一种细胞培养基提取外泌体的方法，其特征在于：所述高渗透压高分子溶液为聚乙二醇、丙烯酸、CH3CONH2、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯或甲基纤维素，所述高渗透压高分子溶液的分子量为1~4K，质量浓度为50％－80％。
6.根据权利要求1所述的一种细胞培养基提取外泌体的方法，其特征在于：所述步骤S3中透析时间为12-24小时透析，过程中置换透析液3~5次。
7.根据权利要求1所述的一种细胞培养基提取外泌体的方法，其特征在于：所述步骤S4中二次透析的透析液为0.9%生理食盐水，所述0.9%生理食盐水溶有15-50万分子量的高分子溶液。
8.根据权利要求1所述的一种细胞培养基提取外泌体的方法，其特征在于：所述步骤S4中二次透析的时间为12-24小时，浓缩后的滤液体积会随透析过程自动增加，体积变为110~200%，过程中置换透析液3~5次。
9.根据权利要求7所述的一种细胞培养基提取外泌体的方法，其特征在于：15-50万分子量的高分子溶液为聚乙二醇， 丙烯酸，CH3CONH2、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯或甲基纤维素的溶液。
10.根据权利要求7所述的一种细胞培养基提取外泌体的方法，其特征在于：15-50万分子量的高分子溶液溶于生理食盐水后质量浓度为10%-20%。
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【技术特征摘要】
1.一种细胞培养基提取外泌体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种细胞培养基提取外泌体的方法，其特征在于：所述步骤s1中预处理为将细胞或是破碎的细胞器进行初步移除。
3.根据权利要求1所述的一种细胞培养基提取外泌体的方法，其特征在于：所述步骤s2中初滤为过0.22-0.45μm滤膜过滤除菌。
4.根据权利要求1所述的一种细胞培养基提取外泌体的方法，其特征在于：所述步骤s3中透析袋外面的透析液为高渗透压高分子溶液。
5.根据权利要求4所述的一种细胞培养基提取外泌体的方法，其特征在于：所述高渗透压高分子溶液为聚乙二醇、丙烯酸、ch3conh2、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯或甲基纤维素，所述高渗透压高分子溶液的分子量为1~4k，质量浓度为50％－80％。
6.根据权利要求1所述的一种细胞培养基提取外泌体的方法，其特征在于：所述步骤s3...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨明嘉，李荣，王鹏，刘洪，周鼎堃，魏宇佩，刘锐，朱欣婷，田书萍，付咏雪，
申请(专利权)人：四川天府亨特生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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