本发明专利技术的课题是提供通过确定与除虫菊酯的生物合成相关的酶的氨基酸序列、及其基因的碱基序列，制作整合有该基因的载体、转化体，并将这些制作技术应用于生长较快的植物，从而高效地生成除虫菊酯的方法。本发明专利技术提供一种基因，是编码作为可以从能生成除虫菊酯的植物体内提取的酶的下述（ｉ）或（ｉｉ）的蛋白质的基因，（ｉ）包含序列号１所示的氨基酸序列的蛋白质，（ｉｉ）包含对序列号１所示的氨基酸序列置换、缺失、插入、和／或添加１个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列、且显示作为除虫菊酯生物合成酶的活性的蛋白质。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及显示作为除虫菊酯生物合成酶的活性的蛋白质、编码该蛋白质的基因和整合有该基因的载体。
技术介绍
除虫菊所含的次级代谢产物除虫菊酯，具有对昆虫显示优异的杀虫活性、另一方面对哺乳动物毒性低这样的作为杀虫成分理想的优点，故而在驱蚊线香、喷雾剂、粉剂等中被广泛使用。虽然近年随着合成拟除虫菊酯惊人发展，对除虫菊酯的需要减少，但是作为来自植物的对环境温和的杀虫剂原料，现在其利用价值仍然较高，故而为了廉价且高效地获得除虫菊酯的研究还在继续。特别是由于作为合成拟除虫菊酯的原材料的石油价格急剧上涨等，上述次级代谢产物除虫菊酯的存在价值重新受到重视。但是，除虫菊酯主要从除虫菊的花部提取，除虫菊在开花之前的生长时间极长，约3年。因此，作为使除虫菊酯生产效率化的方法，除了挑选、育种除虫菊的除虫菊酯高生产抹之外，认为促进同种或异种植物细胞中的除虫菊酯生物合成是有效的。除虫菊酯具有作为单薛羧酸的菊酸与作为脂肪酸氧化代谢物的除虫菊醇酮类(醇)以酯键结合的结构(图3)，人们知道在其生物合成中，菊酸和除虫菊醇酮类分别通过不同的代谢途径生物合成，最后在两者之间形成酯键。作为高效地进行上述除虫菊酯的生物合成的方法，可列举利用与其生物合成相关的基因的方法，在利用这些基因进行除虫菊酯生物合成时，该基因的分离和鉴定是不可缺少的。但是，植物细胞生产的各种酯化合物，是以羧酸的辅酶A(CoA)硫酯体(酰基CoA、 RCO-S-CoA)和醇(R，-OH)作为底物，通过酰基转移酶而生物合成的(图4)，且它们的生物合成例如记载在非专利文献1和非专利文献2中。推测作为这样的酰基转移酶，在除虫菊酯的生物合成中存在以菊酰CoA或拟除虫菊酰CoA和除虫菊醇酮类为底物的菊酰/拟除虫菊酰基转移酶(除虫菊酯生物合成酶)(图5)，但到目前为止没有作为基于M酸序列的具体构成而被分离，更何况对于编码基于该氨基,列的蛋白质的基因，当然也没有特别探求。另外，专利文献1公开了能够对作为除虫菊酯的化学合成的原材料使用的菊基二磷酸生成进行催化的菊基二磷酸合酶(synthase)等酶的氨基*列，以及将基于该氨基^列的蛋白质编码化的基因序列，但对于能够进行上述除虫菊酯的生物合成的酶自身的氨基酸序列和编码基于该氨基酸序列的蛋白质的基因，并没有任何公开和暗示。正如由这样的现有技术的状况明确的那样，对于特别指定除虫菊酯的生物合成所涉及的酶，然后阐明编码该酶蛋白质的基因，从而基于基因工程学上的知识来进行除虫菊酯的有效生物合成，尚未阐明。专利文献l:特表平9-504684非专利文献1: R. Kalscheuer and A. Steinbuchel， A novel bifunctionalwax ester synthase/acyl-CoA:diacylglycero1 acyltransferase mediates waxester and triacylglycerol biosynthesis in Acinetobacter calcoaceticus ADP1.丄Biol. Chem. 278:8075-8082 (2003)^,专禾'文献2: J. Luo等，Convergent evolution in the BAHD family ofacyl transferases: identification and characterization of anthocyanin acyltransferases from Arabidopsis thaliana. 50:678-695 (2007)
技术实现思路
本专利技术的目的是提供通过确定与除虫菊酯的生物合成相关的酶的氨基酸序列、及其基因的碱基序列，制作整合有该基因的载体、转化体，并将这些制作技术应用于生长较快的植物，从而高效地生成除虫菊酯的方法。在解决上述课题时，本专利技术者们如下所述，以除虫菊花为原材料，以除虫菊酯I生成活性为指标进行蛋白质粗分级，并利用使用疏水性树脂的分批法来完成粗纯化，然后通过利用规定组合的色镨法来进行纯化，从而得到与除虫菊酯生成相关的酶蛋白质，然后进行该蛋白质的内部g,列和氨基末端序列分析。使用以通过上述分析而明确的部分氨基酸序列为基础制作的简并引物，以从除虫菊花部得到的cDNA文库为模板进行RACE-PCR，从而扩增出序列未知部分的多核苷酸片段。通过用DNA测序仪分析扩增的多核苷酸片段的碱基序列，从而确定包含图2所示的序列号、即序列号5的碱基序列的除虫菊酯生物合成酶的全长基因的碱基序列，以及由该基因编码的图l(a)所示的序列、即序列号l的氨基,列，以这冲羊的确定为基f出，从而完成本专利技术。本专利技术采用下述构成。(1) 一种除虫菊酯生物合成酶，是通过下述操作生成的分子量约40000的蛋白质，所述操作是以从除虫菊花制备的粗酶溶液为原料，使用(lR)-反式菊酰辅酶A ((1R)-trans-Chrysanthemoyl-CoA)和(S)-除虫菊醇酮((S)-Pyrethrolone)作为检测有无除虫菊酯合成酶活性功能的底物，通过利用硫酸沉淀进行的蛋白质粗分级来得到沉淀物，然后对该沉淀物利用使用疏水性树脂的分批法来进行粗纯化，对上述粗纯化所得的酶溶液，依次进行利用离子交换色谱法进行的纯化、利用疏7jC作用色谱法进行的纯化、通过凝胶过滤进行的纯化的各工序。(2) 下述(i)或(ii)的蛋白质，是可以从能生成除虫菊酯的植物体内提取的酶，(i) 包含序列号1所示的Mi^列的蛋白质，(ii) 包含对序列号1所示的M酸序列置换、缺失、插入、和/或添加1个或多个氨基酸而得到的M酸序列、且显示作为除虫菊酯生物合成酶的活性的蛋白质。6(3) —种蛋白质，是可以从能生成除虫菊酯的植物体内提取的酶，是 包含序列号2所示的M酸序列的蛋白质或包含序列号3所示的M^ 列的蛋白质或包含序列号4所示的M酸序列的蛋白质。(4) 一种基因，编码下述(i)或(ii)的蛋白质，所述蛋白质是可以从能生 成除虫菊酯的植物体内提取的酶，(i) 包含序列号1所示的M酸序列的蛋白质，(ii) 包含对序列号1所示的M酸序列置换、缺失、插入、和/或添加 1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列、且显示作为除虫菊酯生物合成酶 的活性的蛋白质。(5) 根据(4)所述的基因，编码(i)的蛋白质，且包含序列号5所示的碱 基序列。(6) 根据(5)所述的基因，含有序列号5所示的碱基序列的第85位~第 1179位的碱基序列作为开放式阅读框。(7) —种基因，编码包含序列号2所示的氨基i^列的蛋白质、包含 序列号3所示的M酸序列的蛋白质或包含序列号4所示的氨基酸序列的 蛋白质的任一种，所迷蛋白质是可以从能生成除虫菊酯的植物体内提取的 酶。(8) —种栽体，整合有(4) (7)的任一项所迷的基因。 本专利技术公开了与除虫菊酯的生物合成相关的酶的M酸序列、及其基因的碱基序列，从而导出可以介由生长较快的植物来廉价且有效地生产作 为杀虫剂原料有用且安全性高的除虫菊酯的展望，显示了可以对杀虫剂产 业作出较大贡献的可能性。附图说明图1表示本专利技术所涉及的除虫菊酯生物合成酶的氨基酸序列的具体 例，(a)表示从除虫菊的花得到的酶的典型例，(b)表示相对于(a)的JL^, 列移动性的信号序列本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种除虫菊酯生物合成酶，是通过下述操作而生成的分子量约４００００的蛋白质，所述操作是以从除虫菊花制备的粗酶溶液为原料，使用（１Ｒ）－反式菊酰辅酶Ａ和（Ｓ）－除虫菊醇酮作为检测有无除虫菊酯合成酶活性功能的底物，通过利用硫酸沉淀进行的蛋白质粗分级来得到沉淀物，然后对该沉淀物利用使用疏水性树脂的分批法来进行粗纯化，对上述粗纯化所得的酶溶液，依次进行利用离子交换色谱法进行的纯化、利用疏水作用色谱法进行的纯化、通过凝胶过滤进行的纯化的各工序。
【技术特征摘要】
JP 2008-8-13 208295/20081.一种除虫菊酯生物合成酶，是通过下述操作而生成的分子量约40000的蛋白质，所述操作是以从除虫菊花制备的粗酶溶液为原料，使用(1R)-反式菊酰辅酶A和(S)-除虫菊醇酮作为检测有无除虫菊酯合成酶活性功能的底物，通过利用硫酸沉淀进行的蛋白质粗分级来得到沉淀物，然后对该沉淀物利用使用疏水性树脂的分批法来进行粗纯化，对上述粗纯化所得的酶溶液，依次进行利用离子交换色谱法进行的纯化、利用疏水作用色谱法进行的纯化、通过凝胶过滤进行的纯化的各工序。2. 下述(i)或(ii)的蛋白质，是可以从能生成除虫菊酯的植物体内提取的(i) 包含序列号1所示的M酸序列的蛋白质，(ii) 包含对序列号1所示的氨基酸序列置换、缺失、插入和/或添加1 个或多个氛基酸而得到的氨基酸序列、且显示作为除虫菊酯生物合成酶的 活性的蛋白质。3. —种蛋白质，是可以从能生成除虫菊酯的植物体内提取的酶，...
【专利技术属性】
技术研发人员：松田一彦，菊田幸雄，
申请(专利权)人：学校法人近畿大学，大日本除虫菊株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[]
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