【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物，特别涉及一种用于椰心叶甲、水椰八角铁甲和海枣异胸潜甲的快速鉴定方法。
技术介绍
1、棕榈科植物是热带自然生态系统的标志性组分，亦是热区重要的经济作物，具有维持生态系统稳定和促进农民增收的作用。椰心叶甲brontispa longissimi(gestro)、水椰八角铁甲octodonta nipae(maulik)和海枣异胸潜甲javeta pallida(baly)是棕榈科植物椰子、槟榔和中东海枣等作物上的重要外来入侵害虫，取食后可造成叶片皱缩和卷曲等，受害嫩梢慢慢干枯，严重时甚至导致整株植物枯萎死亡。
2、椰心叶甲、水椰八角铁甲和海枣异胸潜甲因具有许多相同的寄主，且生态位比较接近，目前鉴别这三种食叶甲虫主要是依据体形大小、触角形态及构造、前胸背板、鞘翅和生殖器等特征来区分，这种传统的分类方法专业性太强，耗时耗力，很难对食叶甲虫的幼虫或残缺个体进行鉴别。近年来分子生物学技术发展迅速，基于pcr技术的分子鉴定为物种的快速鉴别提供了新的手段，弥补了传统形态鉴定的诸多不足。而且，利用分子标记鉴定物种已有不少的尝试，如吴明月等(瓜果上主要实蝇类害虫pcr-rflp分子鉴定技术的建立及应用[j]，应用昆虫学报，2021)利用pcr-rflp分子鉴定技术完成了瓜果上主要实蝇类害虫的快速鉴定和识别；2020年黄振等(应用ss-pcr技术设计种特异性引物快速鉴定瓜实蝇[j]，安徽农业科学，2020)应用ss-pcr技术设计种特异性引物快速鉴定瓜实蝇。pcr技术以基因组dna为依据，具有检测周期短和不受靶标物
技术实现思路
1、针对现有技术的上述缺陷，本专利技术提出一种用于椰心叶甲、水椰八角铁甲和海枣异胸潜甲，以解决上述
技术介绍
提出的问题。
2、为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、一种用于椰心叶甲、水椰八角铁甲和海枣异胸潜甲的快速鉴定方法，包括以下步骤：
4、(1)提取椰心叶甲、水椰八角铁甲和海枣异胸潜甲的基因组总dna，将基因组总dna的浓度稀释到0.05～0.4μg/ml，得样品dna；
5、(2)利用its1通用引物对步骤(1)所得到的样品dna进行pcr扩增和测序，得its序列；
6、(3)根据步骤(2)所得的its序列设计出三对特异性引物：bl-f/gt-r、on-f/gt-r和jp-f/gt-r；
7、(4)pcr扩增：用特异性引物bl-f/gt-r、on-f/gt-r、jp-f/gt-r中的一种或几种对食叶甲虫样品dna进行pcr扩增，得到pcr产物反应液；
8、bl-f核苷酸序列seq id no.1:gcatcgccgtctcaagaa；
9、gt-r核苷酸序列seq id no.2:caaggtttccgtaggtga；
10、on-f核苷酸序列seq id no.3:gcgttcaactaatgtacc；
11、gt-r核苷酸序列seq id no.2:caaggtttccgtaggtga；
12、jp-f核苷酸序列seq id no.4:atgtgtgtgttgttcggtc；
13、gt-r核苷酸序列seq id no.2:caaggtttccgtaggtga；
14、(5)将步骤(4)所得的pcr产物反应液进行电泳分析：取上述pcr产物反应液5μl与1μl载样缓冲液混合，用1.2％的琼脂糖进行电泳，eb染色，用凝胶成像系统进行拍摄检测；
15、(6)根据电泳显示的pcr扩增片段的大小来判断棕榈食叶甲虫种类，若有明显清晰的628bp的条带，则可判断为是椰心叶甲，若条带为954bp的为水椰八角铁甲，若条带为222bp的则为海枣异胸潜甲。
16、优选地，基因组总dna的浓度稀释到0.1μg/ml，即得样品dna。
17、优选地，步骤(1)中提取椰心叶甲、水椰八角铁甲和海枣异胸潜甲的基因组总dna采用酚氯仿方法提取，具体步骤为：
18、s1、取单头椰心叶甲、水椰八角铁甲和/或海枣异胸潜甲成虫置于1.5ml的离心管中，分别用75％、50％乙醇和纯水梯度洗脱，每个梯度脱水时间为5～10min；
19、s2、洗脱完成后在离心管中加入300μl的dna提取缓冲液(50mmol/ltris-hcl，1mmol/ledta，20mmol/lnacl，1％sds，ph8.0)，用0.2ml的pcr管底部作为匀浆器将其充分研磨，再加入300μl的dna提取缓冲液冲洗匀浆器，得匀浆液；
20、s3、将匀浆液用微量移液器移入新的1.5ml离心管，在管中加入10μl蛋白酶k(20mg/ml)，用封口带将离心管封口，放入56℃摇床中5h；
21、s4、加入等体积的tris饱和酚500μl，摇匀10min后在温度为4℃、转速12000r/min条件下离心7min；
22、s5、吸取上清液到新的离心管，加入等体积的tris饱和酚、氯仿和异戊醇混合液(体积比为25:24:1)450μl，摇匀10min后在温度为4℃、转速12000r/min条件下离心7min；
23、s6、吸取上清液到新的离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇混合液(体积比为24:1)400μl，在温度为4℃、转速12000r/min条件下离心7min；
24、s7、吸取上清液到新的离心管，加入上清液体积2.5倍经过-20℃冷冻的100％酒精，在-20℃过夜，在温度为4℃、转速12000r/min条件下离心7min；
25、s8、弃上清液，留白色沉淀(dna)，加入400μl的经过-20℃冷冻的75％酒精，吹打溶解三次，即可得基因组总dna。
26、优选地，步骤(2)中利用its1通用引物对样品dna进行pcr扩增步骤为：采用internal transcribed spacer regions 1(its1)通用引物进行pcr扩增，pcr反应体系为25μl，其中，样品dna2μl，2×green taq mix酶预混液为12.5μl，its1通用上游引物和下游引物各0.5μl，超纯水9.5μl。扩增程序:94℃预变性5min；40个循环:94℃30s，50℃45s，72℃60s；最后72℃延伸5min。扩增反应在abi-9700pcr基因扩增仪上运行。取5μlpcr扩增产物在1.2％琼脂糖(amresco)凝胶上以90v电泳(bio-rad powerpac basic)分离45min，然后以geldoc universal hoodⅱ型凝胶成像系统(bio-rad laboratories)分析本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于椰心叶甲、水椰八角铁甲和海枣异胸潜甲的快速鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于椰心叶甲、水椰八角铁甲和海枣异胸潜甲快速鉴定方法，其特征在于，所述样品DNA的浓度稀释到0.05～0.4μg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种用于椰心叶甲、水椰八角铁甲和海枣异胸潜甲快速鉴定方法，其特征在于，所述样品DNA的浓度稀释到0.1μg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种用于椰心叶甲、水椰八角铁甲和海枣异胸潜甲快速鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中每20μL PCR反应体系含有：2×Green Taq Mix酶预混液10μL，样品DNA 1.0μL，特异性引物BL-F/GT-R、ON-F/GT-R和/或JP-F/GT-R的上、下游引物各0.5μL，余量为超纯水。
5.根据权利要求1所述的一种用于椰心叶甲、水椰八角铁甲和海枣异胸潜甲快速鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中PCR扩增条件为：在95℃预变性3min；按以下条件进行38个循环，95℃30s，54℃30s，72℃60s，循环结束后在72℃保持
...【技术特征摘要】
1.一种用于椰心叶甲、水椰八角铁甲和海枣异胸潜甲的快速鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于椰心叶甲、水椰八角铁甲和海枣异胸潜甲快速鉴定方法，其特征在于，所述样品dna的浓度稀释到0.05～0.4μg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种用于椰心叶甲、水椰八角铁甲和海枣异胸潜甲快速鉴定方法，其特征在于，所述样品dna的浓度稀释到0.1μg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种用于椰心叶甲、水椰八角铁甲和海枣异胸潜甲快速鉴定方法，其特征在于，步...
【专利技术属性】
技术研发人员：马光昌，温海波，彭正强，唐超，王树昌，金涛，龚治，卓武强，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：
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