【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物学和生物工程领域，尤其是涉及灵菌红素高产突变株的高效筛选方法。
技术介绍
1、灵菌红素是一种含有三吡咯环的天然红色色素，主要由粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)等细菌在次级代谢过程中合成。这一物质具有多种药用潜能，包括抗癌、免疫抑制、抗糖尿病和抗菌等特性，同时也已被用于对抗有害藻华问题。近年来，灵菌红素因其天然来源以及在食品和化妆品等工业领域替代合成色素的潜力而备受瞩目。利用微生物生产这种色素具有多重优势，包括成本效益高、可利用农业和食品来源的废弃物作为廉价培养基、短复制周期、便于纯化以及不受气候条件限制等。
2、鉴于灵菌红素的多样应用前景，急需提高其产量的同时最大程度地降低生产成本。许多研究侧重于通过基因工程手段来调控生物合成途径和代谢网络，以提高产量。然而，由于灵菌红素可能被用作食品添加剂，存在对转基因食品的担忧，因此人们更倾向于采用传统的人工诱变方法。但这需要对突变株进行快速高效的筛选。然而，尽管灵菌红素呈现红色，但在平板培养基上区分不同突变株的颜色变化仍然具有挑战性，难以在平板上直接筛选出产量不同的突变株。而传统的筛选方法通常需要在发酵后测定灵菌红素的产量，这一过程既费时又耗力，效率低下。但是灵菌红素的产量受到多种外部因素的显著影响，
3、因此，本行业急需创造出一种高通量筛选方法，加大筛选平板上不同灵菌红素产量的突变株的颜色区别，从而加快筛选过程。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是提供一种用于高产灵
2、为解决上述技术问题，本专利技术提供一种用于高产灵菌红素突变株的高通量筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
3、1)、将能产灵菌红素的粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)的菌株作为原始菌株，将原始菌株进行突变，从而获得突变菌株；
4、2)、将原始菌株和突变菌株所得的菌液在中等抑制水平培养基平板上划线，于35±0.5℃培养24±0.5h；而后根据原始菌株和突变菌株的颜色进行判断。
5、作为本专利技术的用于高产灵菌红素突变株的高通量筛选方法的改进：
6、当突变菌株为粉红色或红色时，判定该突变菌株为高产灵菌红素突变株。
7、作为本专利技术的用于高产灵菌红素突变株的高通量筛选方法的进一步改进：
8、当突变菌株的红色比原始菌株加深时，说明该突变菌株的灵菌红素产量较原始菌株有提升。
9、作为本专利技术的用于高产灵菌红素突变株的高通量筛选方法的进一步改进：
10、当原始菌株在中等抑制水平培养基平板不呈现颜色(即为无色)，而突变菌株在中等抑制水平培养基平板的颜色为粉红色或红色时，表明该突变菌株为高产灵菌红素的突变株；
11、当原始菌株在中等抑制水平培养基平板为粉红色或红色，表明该原始菌株本身已经是高产灵菌红素的菌株，而突变菌株在中等抑制水平培养基平板的红色加深时，说明，该突变菌株的灵菌红素产量较原始菌株有了进一步提升；反之，则表示该突变菌株的灵菌红素产量较原始菌株没有提升。
12、作为本专利技术的用于高产灵菌红素突变株的高通量筛选方法的进一步改进：
13、中等抑制水平培养基平板为：蔗糖10g/l、胰蛋白胨10g/l、nacl 5g/l、cacl2 5g/l、mgso4 1g/l，kh2 po40.2g/l，葡萄糖3g/l，酵母提取物0.6g/l，氯化铁2g/l，(nh4)2so410g/l，氯化铬0.04g/l；琼脂15g/l、ph值维持在7.2。
14、本专利技术的原始菌株当选择粘质沙雷氏菌hk2时，灵菌红素产量约为205mg/l时，其在中等抑制水平培养基平板不呈现颜色(即为无色)。
15、本专利技术针对现有技术存在的问题，提出了一种改进的方法，通过筛选不同环境因子对灵菌红素产量的抑制效果，并将这些因子合理组合，创造了一种高通量的筛选方法。该方法通过使低产菌株在平板培养基上呈浅色甚至无色，而高产菌株仍然呈现红色，从而增强了不同产量突变株在平板上的颜色差异。产灵菌红素的菌株人工诱变后通过本专利技术设定的高通量筛选方法，可以获得灵菌红素高产突变株。
16、说明：高产是指要求灵菌红素产量＞210mg/l。
17、本专利技术的专利技术过程包括以下：
18、1、筛选负调控环境因子：
19、首先，本专利技术在固体平板和液体培养基中筛选了多个环境因子，研究其是否能够抑制粘质沙雷氏菌产生灵菌红素。这些因子包括温度、葡萄糖、葡萄糖酸、磷酸盐、酵母提取物、铵盐、铁离子和铬盐。
20、为了进行筛选，首先将粘质沙雷氏菌细胞接种在lb琼脂斜面上，然后将此细胞转移到lb液体培养基中，在30℃的温度下以每分钟200转的速度搅拌培养24小时。所得培养物被用作预培养物。
21、在液体培养时，预培养物按照1:10的体积比例接种到添加不同浓度环境因子的基础发酵液体培养基中。每次筛选只设定一个环境因子的条件。这些环境因子的种类和浓度如表1所示。除了温度因子的筛选需要在不同温度下进行外，其他环境因子的筛选均在30℃的固定温度下进行。培养24小时后，测定了灵菌红素的产量。
22、表1筛选影响灵菌红素产量的因素及其设定值
23、
24、在固体平板培养时，除了添加15g/l的琼脂作为凝固剂外，其他条件均与液体培养相同。
25、基础发酵液体培养基为蔗糖10g/l、胰蛋白胨10g/l、nacl 5g/l、cacl2 5g/l、mgso41g/l，ph值维持在7.2。
26、为了测定灵菌红素的含量，培养结束后，将1ml培养液用4ml酸化乙醇(ph 3.0，95％v/v)稀释，然后在避光条件下震荡30分钟，以促使灵菌红素的提取。随后，将混合物在12000rpm的速度下离心5分钟，上清液用于测定od535下的灵菌红素含量。
27、酸化乙醇(ph 3.0，95％v/v)的制备方法为：在95％的乙醇水溶液中加入浓盐酸，直至ph 3.0。
28、2、人工诱变。
29、人工诱变是通过使用微波和紫外线进行的。首先，将在30℃培养的粘质沙雷氏菌用无菌生理盐水洗涤三次，然后用无菌生理盐水调整细胞浓度为每毫升1×108细胞。接下来，将10毫升细胞悬浮液加入直径为9厘米的培养皿中，并使用300瓦的微波照射细胞5秒钟。随后，将培养皿放入冰水中冷却55秒，然后再重复该过程九次。而后，将细胞放入磁力搅拌器下，经过90秒的紫外线辐射(30瓦，距离30厘米)以进行进一步的紫外诱变。
30、3、建立突变菌株的高通量筛选方法。
31、经诱变处理后的细胞在适当稀释后被涂布到高通量筛选平板上。高通量筛选平板在基础发酵培养基平板上分别添加了三种不同抑制水平的筛选因子组合。这些筛选因子的种类和浓度取决于步骤1中的筛选结果高水平抑制组的每个因子导致灵菌红素的产量降低约70％，中等抑制组降低约5本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于高产灵菌红素突变株的高通量筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的用于高产灵菌红素突变株的高通量筛选方法，其特征在于：
3.根据权利要求1或2所述的用于高产灵菌红素突变株的高通量筛选方法，其特征在于：
4.根据权利要求2或3所述的用于高产灵菌红素突变株的高通量筛选方法，其特征在于：
5.根据权利要求1～4任一所述的用于高产灵菌红素突变株的高通量筛选方法，其特征在于：
6.根据权利要求1～5任一所述的用于高产灵菌红素突变株的高通量筛选方法，其特征在于：原始菌株为粘质沙雷氏菌HK2。
【技术特征摘要】
1.用于高产灵菌红素突变株的高通量筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的用于高产灵菌红素突变株的高通量筛选方法，其特征在于：
3.根据权利要求1或2所述的用于高产灵菌红素突变株的高通量筛选方法，其特征在于：
4.根据权利要求2或...
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