【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，特别涉及一种转基因斑马鱼在制备急性髓系白血病动物模型中的应用。
技术介绍
1、t(1；19)(q23；p13)是白血病中最常见的染色体易位，导致5％-7％的儿童急性淋巴细胞白血病(all)[1,2]以及急性髓性白血病(aml)/混合表型急性白血病(mpal)[3]。e2a-pbx1易位的all患者e2a-pbx1都具有很高的复发风险，并且这种易位还与已知的高风险临床特征相关，包括诊断时白细胞计数升高和中枢神经系统白血病[4,5]。此外，先前的一项研究表明，e2a-pbx1融合基因可作为诱导化疗后有效的最小残留病(mrd)标志物，该基因早期快速转阴的患者复发率相对较低[6,7]。e2a-pbx1阳性患者还表现出高风险的临床特征，包括高细胞计数、高血清乳酸脱氢酶水平和中枢神经系统(cns)受累[3]。尽管最近的强化治疗方案和异基因造血干细胞移植改善了e2a-pbx1成人all患者的预后[8]，但其全身毒性和高昂的费用也不容忽视。
2、t(1；19)(q23；p13)融合产生的e2a-pbx1蛋白结合了e2a的n端反式激活结构域(也称为tcf3)和pbx1的c端dna结合同源结构域[9]。作为b淋巴细胞生成的主要调节因子，e2a决定b细胞谱系的分化[10]，在维持造血干细胞库和促进骨髓淋巴细胞和骨髓红细胞祖细胞的成熟方面也发挥着重要作用[11]。pbx1是一种tale(三氨基酸环延伸)转录因子，可与hox家族的其他成员相互作用，增强其dna结合特异性和亲和力[12]。pbx1不仅在调节形态模式、器官发生
3、已有报道通过在小鼠淋巴系统中特异性诱导e2a-pbx1的表达构建all疾病动物模型[14-16]，以及体外通过逆转录病毒载体将e2a-pbx1转导至小鼠骨髓祖细胞中的aml模型[13,17]。但由于缺乏可条件诱导且可以用于药物筛选的e2a-pbx1的aml动物模型，致使e2a-pbx1介导白血病发生的机制仍不清楚(特别是在aml白血病中)。更重要的是，临床上仍然缺乏针对e2a-pbx1白血病的有效靶向药物。
4、斑马鱼已被证明是研究造血系统疾病的绝佳模型，特别是在广泛的治疗化合物筛选中，因为它们透明、体型小、寿命短(2-3年)、繁殖力高以及与人类的遗传相似性[18]。通过突变或者过表达一些原癌基因建立起与血液肿瘤相关的越来越多的斑马鱼突变体和转基因系[19,20]。利用斑马鱼白血病模型不仅可以进一步研究人白血病发病的分子机制，还可以在体内进行新的小分子化合物的药筛。斑马鱼是进行药物研发的理想模式动物[21,22]。斑马鱼相比于小鼠更适合做大规模的药物筛选，具有成本低、高效等优势。斑马鱼用于药物筛选可以实现以下益处：高通量：斑马鱼产卵数量多，且受精后的1天开始加药，2-5天后检测，在此期间卵黄可提供胚胎营养而不用喂食，使得可以用96孔或384孔板进行药物筛选。低费用：斑马鱼饲养和消耗的费用远远低于小鼠，平均每天每只消费约为小鼠的1/100。给药方便：可直接将化合物溶于水中，扩散至胚胎，所需化合物的量仅为小鼠的1/100-1/1000。但到目前为止，尚未有利用斑马鱼构建的aml模型的相关报道。
技术实现思路
1、本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种转基因斑马鱼在制备急性髓系白血病(aml)动物模型中的应用。
2、本专利技术的另一目的在于提供一种转基因斑马鱼在制备用于筛选对急性髓系白血病(aml)有效的药物的动物模型中的应用。
3、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
4、一种转基因斑马鱼在制备急性髓系白血病动物模型中的应用，其中，所述的转基因斑马鱼为tg(hsp70:e2a-pbx1-egfp)转基因斑马鱼，其通过如下方法制备得到：
5、(1)将e2a-pbx1融合基因连接到ptal2-hsp70-egfp质粒(带有hsp70基因启动子和tol2转座子识别位点的质粒)中，得到重组质粒ptal2-hsp70-e2a-pbx1-egfp；其中e2a-pbx1融合基因的cdna片段如seq id no：1所示；
6、(2)将重组质粒ptal2-hsp70-e2a-pbx1-egfp与tol2转座酶mrna通过显微注射的方式在斑马鱼胚胎发育的1细胞时期导入到斑马鱼胚胎中(在转座酶的作用下，将转基因载体上两个tol2识别位点序列之间的基因dna片段整合到斑马鱼的基因组上)，得到tg(hsp70:e2a-pbx1-egfp)转基因斑马鱼胚胎；
7、(3)将tg(hsp70:e2a-pbx1-egfp)转基因斑马鱼胚胎置于28.5℃恒温培养箱中培育，并实施热激处理得到所述转基因斑马鱼的幼鱼或成鱼；其中，幼鱼的热激处理条件为：在受精后11～12小时(hpf)，给于39.5℃热激1h，受精后1～3天(dpf)或受精后1～5天(dpf)每天给予39.5℃热激处理2次，每次热激2h；成鱼的热激处理条件为：在受精后3～12个月(mpf)，每天给予39.5℃热激处理2次，每次热激2h，热激1～3个月。
8、步骤(1)中所述的e2a-pbx1融合基因优选为通过pcr扩增的方式从人escc细胞系te-1细胞cdna中分别获得的，具体步骤如下：将e2a和pbx1的cdna片段分别带有agei/sphi酶切位点的，再通过overlap pcr的方式将e2a和pbx1的cdna片段连接在一起，得到e2a-pbx1融合的cdna片段(seq id no：1)。
9、步骤(2)中所述的tol2转座酶mrna是从pcs2-tol2转座酶载体通过mmessagemmachine系统体外转录的tol2转座酶mrna，其核苷酸序列如seq id no：2所示。
10、所述的急性髓系白血病(aml)是由e2a-pbx1表达引起的，即由tg(hsp70:e2a-pbx1-egfp)转基因斑马鱼在热激条件下激活hsp70启动子诱导e2a-pbx1表达引起的。
11、所述的急性髓系白血病(aml)的症状为幼鱼时期造血干细胞(hspcs)的髓样分化倾向和髓样增殖，以及成鱼时期出现类aml白血病血象、肾脏肿大和髓系的肌肉组织浸润；其中，成鱼时期aml白血病血象为外周血(pb)或者肾脏血(km)出现的髓样祖细胞占白细胞的比例超过20％。
12、所述的急性髓系白血病(aml)在通过小分子药物治疗后症状缓解；其中，小分子药物包括化疗药物阿糖胞苷(cytarabine/ara-c)和小分子抑制剂中的至少一种。
13、所述的小分子抑制剂包括炎症通路、自噬通路、凋亡通路和tnf/il-17/mapk通路抑制剂中的至少一种；优选为l-精氨酸盐酸盐、a-484954、glpg1837、lrrk2-in-1，cid4421684、oul35和kj-pyr-9中的至少一种；更优选为kj-pyr-9、ou本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种转基因斑马鱼在制备急性髓系白血病动物模型中的应用，其特征在于：所述的转基因斑马鱼为Tg(hsp70:E2A-PBX1-EGFP)转基因斑马鱼，其通过如下方法制备得到：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的急性髓系白血病是由Tg(hsp70:E2A-PBX1-EGFP)转基因斑马鱼在热激条件下激活hsp70启动子诱导E2A-PBX1表达引起的。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
6.一种由权利要求1中所述的方法制备得到的急性髓系白血病动物模型的用途，其特征在于：将该模型用于筛选或鉴定能够预防、缓解或者治疗急性髓系白血病的药物。
7.权利要求1中所述的转基因斑马鱼在制备用于筛选对急性髓系白血病有效的药物的动物模型中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的急性髓系白血病是由Tg(hsp70:E2A-PBX1-EGFP)转基因斑马鱼在热激条件下激活hsp70启动子诱导E2
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
...【技术特征摘要】
1.一种转基因斑马鱼在制备急性髓系白血病动物模型中的应用，其特征在于：所述的转基因斑马鱼为tg(hsp70:e2a-pbx1-egfp)转基因斑马鱼，其通过如下方法制备得到：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的急性髓系白血病是由tg(hsp70:e2a-pbx1-egfp)转基因斑马鱼在热激条件下激活hsp70启动子诱导e2a-pbx1表达引起的。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
6.一种...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘伟，张文清，黄志斌，罗海萍，李崎崎，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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