一种清洁纯化紫杉醇的方法技术

本发明专利技术是一种纯化紫杉醇粗产物，清洁制备精产品的方法。该方法使用填充色谱柱，常压下经梯度淋洗含１０～４８％紫杉醇的粗产品，以５０～３００目硅胶填充制备的色谱柱，用无毒性的正构烷烃（正戊烷～正辛烷）、乙酸酯（乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯）为淋洗剂，常压下分离纯化紫杉醇。淋洗后的溶液经旋转蒸发回收溶剂，溶液浓缩后的分段产物经真空冷冻干燥，获得９９．５％～９９．９％的紫杉醇。该方法工艺简单，成本低，纯化过程无污染，溶剂、淋洗剂可以回收，便于工业化生产。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是。紫杉醇是一种具有广谱抗癌活性的天然有机化合物。1971年Wani(JAmer.Chem.Soc.,1971,93,2325)等首次报道从印度短叶红豆杉(Taxuobrevifolia)中分离得到了紫杉醇，并且确认紫杉醇对肺癌、肝癌、乳房癌细胞及其它肿瘤细胞具有广泛的强杀伤作用，副作用非常小。它的分子式为C47H51NO14，分子结构如下 1979年Schiff等(Nature,1979,277,665)确认紫杉醇药理作用机理独特，既能促进微管蛋白的聚合，又能稳定微管不致解聚。1983年美国食品和药品署(FDA)批准进入Ⅰ期临床，目前已进入第Ⅲ期临床试验，被认为是近20年来发现的最有希望的抗癌药。紫杉醇的来源极为有限。它是从紫杉科树木的树皮中提取和纯化来的，树皮中含量约40～160mg/kg。该树种生长极为缓慢，通常一棵百年老树的树干直径约6英寸，每棵树上一般只能剥取2.5kg的树皮。提取25kg的纯紫杉醇提供1万2千例癌症患者临床试验，相当于需要3万棵紫杉树的树皮。美国、加拿大、印度等国家有紫杉树自然资源，我国东北红豆杉(T.cuspidata)、云南红豆杉(T.yunnanensis)和美丽红豆杉(T.chinensis var.mairei)的树皮、树干和杉叶中均含有紫杉醇，但含量较低。为了获取紫杉醇的来源，保护稀少树种，国外开展了红豆杉树的矮壮化及组织培养法，还有半合成及全合成紫杉醇的工作。然而，由于培养法每天仅获得纳克级的量，全合成得率较低，成本巨大，难以商业化。因此，从树中提取紫杉醇，特别是尽可能全部提取出紫杉醇，是目前唯一的、商业化的方法。常用的分离和纯化步骤为使用甲醇或95％乙醇浸提树皮，除去溶剂，得浸膏用水溶解，脱脂后用二氯甲烷或三氯甲烷萃取；萃取组分浓缩后，经色谱层析得到紫杉烷类化合物的单体或混合物。使用浸提法从树皮中提取紫杉醇粗产物较为容易，但是将10～48％的粗产品直接纯化得到99.5～99.9％的精产品技术难度较大。另外，溶剂或淋洗剂不经回收直接排放，造成严重的环境污染。Senilh(J.Natural Products,1984,47,131)等从欧洲杉(Taxul bacata)提取紫杉醇使用如下步骤(1)用乙醇萃取树皮，浓缩；(2)在水和二氯甲烷中分配；(3)“过滤”色谱法分离；(4)硅胶柱色谱分离；(5)氧化铝色谱分离；(6)中压硅胶柱色谱分离；(7)制备HPLC分离。Polysciences Inc.从T.brevifolis树皮中分离紫杉醇(1)甲醇或乙醇萃取树皮，混合萃取后浓缩除去大部分醇；(2)浓缩液用二氯甲烷萃取，萃取质浓缩干燥至粉末；(3)粉末用丙醇和里格罗因(1∶1)溶解，不溶组分过滤除去；(4)含有紫杉醇的滤液浓缩，溶于30％丙醇里格罗因溶液，经Florisil柱过滤；(5)从柱中流出的紫杉醇组分结晶纯化二次；(6)结晶的紫杉醇进一步在硅胶柱中分离，该步中，最相似的产物cephalomannine从紫杉醇中分离出来；(7)从柱中流出的紫杉醇再结晶二次；(8)未分离的混合物和其它溶质，循环处理得到纯紫杉醇。Miller(J.Org.Chem,1981,46,1469)采用下列步骤(1)用甲醇萃取Taxus wallichiana树根、树干、树叶，浓缩萃取液至固体；(2)在水和己烷中分配；(3)用氯仿萃取，然后浓缩；(4)硅胶柱色谱法；(5)二次硅胶柱色谱法；(6)逆流分配法；(7)二次逆流分配法；(8)制备HPLC分离纯化。使用正相硅胶柱色谱法从Ornamental yew(Taxus Xmedia Hicksii)中提取(usp.5,279,949)(1)用70％乙醇萃取鲜叶；(2)萃取物中活性炭脱色后过滤；(3)萃取质浓缩除去大部分有机溶剂；(4)水溶性组分离心与含紫杉醇的沉淀固体分离；(5)固体进入正相硅胶柱色谱分离；(6)二次柱色谱分离，低压硅胶柱色谱分离粗紫杉醇组分；(7)反相色谱最后纯化。Caster等(usp.5,440,055)用超临界法，同时使用N2O、CO2、C3H8、Freon-22或CHClF2等作为超临界气体，提取紫杉醇。Rao等(usp.5,380,916,1992)使用臭氧处理分离后的紫杉醇得纯紫杉醇(同时参见WO92/07842)。1998年3月Durand等(usp.5,723,635)专利技术了利用离心分配色谱法分离纯化紫杉醇的方法。该方法使用一个色谱柱可以良好地从粗物质中分离纯化紫杉醇，一次处理量大(1)在制备柱规模下，用反相色谱法处理紫杉醇粗处理物；(2)从吸附剂上洗脱紫杉醇和其它产物；(3)在洗脱的柱子中回收紫杉醇和相似物；(4)使用臭氧纯化最终产物。上述诸多分离纯化方法，包括结晶法，高压正相色谱法，高压反相色谱法，离心分配色谱法和超临界萃取法等均需要高压、真空或超临界状态下进行，产品纯度仅在99％，主要杂质是cephalomannine，很难分离；制备高纯度的紫杉醇，还需要用臭氧或四氯化铯等处理；溶剂、淋洗液未回收，造成环境污染。本专利技术的目的是建立一种工艺方法简单、纯化过程中无污染、淋洗液或溶剂可回收再使用、便于工业化且能得到高纯度紫杉醇的方法。本专利技术使用市售10～48％紫杉醇产品为原料，正构烷烃、乙酸酯、分析用乙醇、乙腈等试剂均为分析纯，经蒸馏后使用。分析用甲醇为高效液相色谱纯，水为二次重蒸水，硅胶、活性炭纤维为分析纯。原料及产品分析使用的高效液相色谱仪为美国Beckman公司生产，110B双泵进样。128二极管振列检测器或126紫外检测器，4.6×250mmC18色谱柱，流速为1.0ml/min，进样量为3μl。奔腾ⅡMMX266计算机控制高效液相色谱分析操作。Sbsz-Ⅰ型旋转蒸发仪，KLG-Ⅱ型冷冻干燥机，CS501-SP超级数显校温器，WZZ-2A自动旋光仪，WKS-1A数字熔点仪。质谱分析在美国CE&A公司生产的TOF-2000MIP飞行时间二次离子质谱仪上进行，电子能量15kev，荷质比m/e在0～1000范围内扫描。液-质连谱分析在美国惠普HP1100-MS上进行，Zorbax2.1×100mmC18色谱柱，5μm，流速为0.3ml/min，进样量为5μl,APES源，传输电压为70伏，扫描范围为m/z在200～1200之间。本专利技术在纯化紫杉醇之前，需自装色谱柱。人工装柱加入硅胶填料时敲打柱子使其均匀装入，装好后的柱子柱内填料应无明显的断层或裂纹。紫杉醇粗产物溶于乙酸酯后，倒入色谱柱，加入正构烷烃、乙酸酯及其混合物梯度洗脱，各梯度溶剂和混合溶剂比例是正构烷烃(100％)、正构烷烃∶乙酸酯(4∶1～2)、正构烷烃∶乙酸酯(1∶1～4)、乙酸酯(100％)。市售紫杉醇粗产品纯度是10～48％，将其配制成紫杉醇浓度是2.5～10％(wt％)的乙酸酯溶液待纯化用，浓度太稀纯化效率不高，浓度太大纯化效果不好。梯度淋洗用溶剂正构烷烃是正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷，乙酸酯是乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯。为提高纯化纯化效率，纯化用色谱柱长30-80cm，柱直径2.0～8.0cm为好。为使纯化后产品不带杂色，本专利技术用色谱柱上端装有25～35％硅胶体积的活性炭纤维，装柱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种清洁纯化紫杉醇的方法。其特征是在： （１）纯化是用填充硅胶的色谱柱； （２）淋洗液的加入顺序是正构烷烃（１００％）、正构烷烃∶乙酸酯（４∶１～２）、正构烷烃∶乙酸酯（１∶１～４）、乙酸酯（１００％），正构烷烃是正戊烷～正辛烷； （３）分段收集淋洗液，经蒸发、浓缩、干燥，即得纯化后产品； （４）溶于乙酸酯配成溶液后的紫杉醇浓度是２．５～１０％（ｗｔ％），待纯化。

【技术特征摘要】
1．一种清洁纯化紫杉醇的方法。其特征是在(1)纯化是用填充硅胶的色谱柱；(2)淋洗液的加入顺序是正构烷烃(100％)、正构烷烃∶乙酸酯(4∶1～2)、正构烷烃∶乙酸酯(1∶1～4)、乙酸酯(100％)，正构烷烃是正戊烷～正辛烷；(3)分段收集淋洗液，经蒸发、浓缩、干燥，即得纯化后产品；(4)溶于乙酸酯配成溶液后的紫杉醇浓度是2.5～10％(wt％)待纯化。2．根据权利要求1所述的清洁纯化紫杉醇的方法，其特征是色谱柱长30...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈建民，邓名莉，郑志坚，王康跃，鲍余钦，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]