【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，尤其是涉及一种可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球及其制备方法与应用。
技术介绍
1、外泌体是由细胞分泌的直径30–150nm的膜性囊泡，包含母体细胞的rna、dna、蛋白质等物质，是细胞间物质通讯的重要媒介。近年来，干细胞(多能干细胞、间充质干细胞等)来源的细胞外囊泡表现出了替代干细胞治疗的巨大潜力。广泛的研究显示，干细胞分泌的外泌体可通过向受体细胞传递干细胞物质，以调控细胞稳态、延缓细胞衰老、抑制组织炎症等，进而实现促进组织修复、缓解疾病症状的治疗功能。鉴于干细胞外泌体丰富的治疗功能和其良好的生物安全性，它们极具临床转化应用价值。然而，目前如何实现干细胞外泌体在治疗部位的长效作用仍然是阻碍其转化应用的关键技术问题。
2、水凝胶材料为外泌体的长效控释提供了潜在的载体。水凝胶是一种亲水性交联聚合物，具有良好的生物相容性，可以通过骨架材料、降解速度、交联密度等参数的优化实现所负载物质的长效控释。近年来，研究人员开发了多种外泌体控释水凝胶材料(cn202110203774.4、cn201810643146.6等)。然而这些水凝胶面临着材料制备复杂、难以通过微创方法给药、交联方法反应活性高、难以在作用部位有效粘附等问题。因此，目前亟需设计新型的水凝胶载体以实现干细胞外泌体的在治疗部位的长效控释。
技术实现思路
1、为了解决上述现有技术中提及的水凝胶面临着材料制备复杂、难以通过微创方法给药、交联方法反应活性高、难以在作用部位有效粘附等问题，本专利
2、本专利技术公开了一种可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球，以通过无创方式进行给药，实现外泌体在作用部位的长效控释。
3、本专利技术中，将具有良好生物相容性、fda批准的水溶性聚合物(透明质酸和聚乙二醇)通过温和的diels-alder反应实现水凝胶微球的制备。同时，多巴胺修饰的透明质酸可以通过与组织或外泌体表面蛋白的氢键、π-π作用等非共价键作用实现水凝胶微球在组织表面的粘附和外泌体的长效释放。此外，水凝胶微球可通过注射器针头，因此可以通过注射的无创方式进行给药。
4、肌腱病是一种常见的运动系统疾病，通常由肌肉纤维的过度使用和反复强烈牵拉导致肌腱胶原纤维发生退行性病变。目前，相关研究显示，干细胞分泌的外泌体可有效缓解肌腱疼痛和炎症，是一种潜在的肌腱病治疗因子。然而，如何保证干细胞来源的外泌体在肌腱部位的长效释放是其治疗肌腱病的关键技术挑战。只有与组织形成良好、强力的粘附界面，才能保证水凝胶微球在肌腱组织表面稳定粘附、防止微球在肌肉运动过程中脱落或移动。因此，本专利技术进一步将所制备的具有良好组织粘附性能的水凝胶微球用于肌腱部位干细胞外泌体的长效释放以缓解肌腱病症状。
5、本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
6、本专利技术首先提供一种可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球，由以下组分组成：
7、2-呋喃甲胺修饰的透明质酸，结构式i，简写为fha；
8、端基马来酰亚胺修饰的聚乙二醇，结构式ii，简写为mal-peg-mal；
9、多巴胺修饰的透明质酸，结构式iii，简写为daha；和，
10、干细胞分泌的外泌体，简写为sc-sevs。
11、
12、
13、上述外泌体控释水凝胶微球组分中，fha和mal-peg-mal主要用于通过diels-alder交联反应形成水凝胶微球；daha主要通过多巴胺基团介导的与组织蛋白、多糖等分子间的多种非共价键结合作用实现水凝胶微球与组织界面的粘附并延长外泌体的缓释时间；干细胞外泌体主要发挥疾病的治疗功能。
14、在本专利技术的一个实施方式中，水凝胶微球中，2-呋喃甲胺修饰的透明质酸的质量浓度分数为1％～5％，端基马来酰亚胺修饰的聚乙二醇的质量浓度分数为1％～10％，多巴胺修饰的透明质酸的质量浓度分数为1％～5％，干细胞分泌的外泌体的颗粒浓度为1×109/ml～5×1011/ml。
15、在本专利技术的一个实施方式中，水凝胶微球中，2-呋喃甲胺修饰的透明质酸的质量浓度分数为2.5％，端基马来酰亚胺修饰的聚乙二醇的质量浓度分数为5％，多巴胺修饰的透明质酸的质量浓度分数为1.5％，干细胞分泌的外泌体的颗粒浓度为1×109/ml～5×1011/ml。
16、在本专利技术的一个实施方式中，所述2-呋喃甲胺修饰的透明质酸中2-呋喃甲胺的修饰率为透明质酸羧基总数的20％～80％，优选为40％～60％。
17、在本专利技术的一个实施方式中，所述端基马来酰亚胺修饰的聚乙二醇的分子量为1kda～10kda，优选为2kda。
18、在本专利技术的一个实施方式中，多巴胺修饰的透明质酸中，多巴胺的修饰率为透明质酸羧基总数的20％～80％，优选为60％。
19、在本专利技术的一个实施方式中，所述2-呋喃甲胺修饰的透明质酸(结构式i，fha)的制备方法为：
20、室温下，将透明质酸(质均分子量100kda)充分溶解于4-吗啉乙磺酸(mes)缓冲液(ph＝6.0)，配置成质量分数1％的溶液。随后，向溶液中加入一定质量的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmtmm)，室温搅拌。充分反应30min后，加入一定质量的2-呋喃甲胺，反应溶液室温下搅拌24h。随后，将反应液按1:5的体积比加入到无水乙醇中进行沉淀。将沉淀物用水再次溶解，室温透析后冷冻干燥，获得结构式i所示的物质。
21、所述2-呋喃甲胺修饰的透明质酸的制备过程中，通过调控dmtmm、2-呋喃甲胺的投料量的变化，以控制最终产物中2-呋喃甲胺的修饰率。
22、在本专利技术的一个实施方式中，所述端基马来酰亚胺修饰的聚乙二醇(结构式ii，mal-peg-mal)可以通过商业化途径获得。
23、在本专利技术的一个实施方式中，所述多巴胺修饰透明质酸(结构式iii，daha)的制备方法为：
24、室温下，将透明质酸(质均分子量400kda)充分溶解于4-吗啉乙磺酸(mes)缓冲液(ph＝6.0)，配置成质量分数1％的溶液。随后，向溶液中加入一定质量的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmtmm)，室温搅拌。充分反应30min后，加入一定质量的盐酸多巴胺，反应溶液在4℃下搅拌24h。随后，将反应液按1:5的体积比加入到无水乙醇中进行沉淀。将沉淀物用水再次溶解，4℃透析后冷冻干燥，获得结构式iii所示的物质。
25、通过调控dmtmm、盐酸多巴胺的投料量改变以控制最终产物中多巴胺的修饰率。
26、在本专利技术的一个实施方式中，所述干细胞分泌外泌体(sc-sevs)的收集和纯化方法如下：
27、标准条件下(3本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球，其特征在于，由以下组分组成：
2.根据权利要求1所述的一种可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球，其特征在于，水凝胶微球中，2-呋喃甲胺修饰的透明质酸的质量浓度分数为1％～5％，端基马来酰亚胺修饰的聚乙二醇的质量浓度分数为1％～10％，多巴胺修饰的透明质酸的质量浓度分数为1％～5％，干细胞分泌的外泌体的颗粒浓度为1×109/mL～5×1011/mL。
3.根据权利要求2所述的一种可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球，其特征在于，水凝胶微球中，2-呋喃甲胺修饰的透明质酸的质量浓度分数为2.5％，端基马来酰亚胺修饰的聚乙二醇的质量浓度分数为5％，多巴胺修饰的透明质酸的质量浓度分数为1.5％，干细胞分泌的外泌体的颗粒浓度为1×109/mL～5×1011/mL。
4.根据权利要求1所述的一种可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球，其特征在于，所述2-呋喃甲胺修饰的透明质酸中2-呋喃甲胺的修饰率为透明质酸羧基总数的20％～80％；
5.权利要求1-4中任一项所述的一种可注射、组织粘附性
6.根据权利要求5所述的一种可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球的制备方法，其特征在于，所述的生物相容性介质为生理盐水、生理缓冲液或细胞培养基。
7.根据权利要求5所述的一种可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球的制备方法，其特征在于，水凝胶前体溶液与矿物油的体积比1:1000～1:20；
8.含有权利要求1-4中任一项所述可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球的试剂盒，其特征在于，该试剂盒由两部分组成：装载于一次性注射器中的可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球和生理盐水。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述一次性注射器为1mL，可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球的容量为250μL，多能干细胞来源外泌体的负载量为1×1011/mL，生理盐水的容量为500μL。
10.权利要求1-4中任一项所述可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球在制备治疗肌腱疾病的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球，其特征在于，由以下组分组成：
2.根据权利要求1所述的一种可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球，其特征在于，水凝胶微球中，2-呋喃甲胺修饰的透明质酸的质量浓度分数为1％～5％，端基马来酰亚胺修饰的聚乙二醇的质量浓度分数为1％～10％，多巴胺修饰的透明质酸的质量浓度分数为1％～5％，干细胞分泌的外泌体的颗粒浓度为1×109/ml～5×1011/ml。
3.根据权利要求2所述的一种可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球，其特征在于，水凝胶微球中，2-呋喃甲胺修饰的透明质酸的质量浓度分数为2.5％，端基马来酰亚胺修饰的聚乙二醇的质量浓度分数为5％，多巴胺修饰的透明质酸的质量浓度分数为1.5％，干细胞分泌的外泌体的颗粒浓度为1×109/ml～5×1011/ml。
4.根据权利要求1所述的一种可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球，其特征在于，所述2-呋喃甲胺修饰的透明质酸中2-呋喃甲胺的修饰率为透明质酸羧基总数的20％～80％；
5.权利要求1-4中...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨云龙，汪泱，杜雨航，
申请(专利权)人：上海泌靓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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