基因调节肽制造技术

本发明专利技术涉及在细胞内调节基因表达，也称为基因控制，特别涉及各种疾病的治疗。本发明专利技术提供了一种在细胞中调节基因表达的方法，包括提供信号传导分子给所述细胞，所述信号传导分子包含一种肽或其功能类似物。另外，本发明专利技术提供了一种鉴别或获得一种信号传导分子的方法，所述分子包含能在细胞中调节基因表达的一种肽或其功能衍生物或类似物，所述方法包括提供一种肽或其衍生物或类似物给所述细胞，并确定基因转录因子的活性和／或核转位。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及与治疗多种疾病如炭疽热相关的调节基因在细胞中的表达，也称为基因控制。如述，炭疽热是一种动物和人类疾病，并由于作为生物战争和恐怖主义的制剂而造成明显的威胁。其中吸入炭疽芽胞杆菌的孢子的吸入性炭疽热几乎总是致命的，因为在疾病进展为抗生素治疗无效的时间点之前几乎不可能加以确诊。炭疽芽胞杆菌的主要毒性因子是一种多-D-谷氨酸荚膜和炭疽热毒素。炭疽热毒素由一同作用的三种独特的蛋白质组成两种酶，致命因子(LF)和水肿因子(EF，一种腺苷酸环化酶)；及保护性抗原(PA)。PA是一种4个结构域的蛋白质，通过其羧基末端结构域与宿主细胞表面受体结合；通过类弗林蛋白酶对其N末端结构域进行裂解使PA形成七聚体，其与毒性酶通过同源N末端结构域而高亲和性结合。所述复合物被胞吞，内涵体的酸化导致PA七聚体通过形成一个14链的β桶而插入膜中，随后毒性酶通过一种未知机制转位于细胞质中。PA与LF的二元组合当静脉内给予时足以诱导动物迅速死亡，而且某些金属蛋白酶抑制剂在体外阻断所述毒素的作用。因此，LF是治疗剂的潜在靶，所述治疗剂抑制其催化活性或阻断其与PA的结合。LF是一种蛋白质(相对分子量为90,000)，其在炭疽热的发病机理中很关键。其包含4个结构域结构域I结合炭疽热毒素的膜转位成分，PA；结构域II，III和IV一起产生一个长深凹陷，其在裂解之前持有有丝分裂原活化蛋白激酶激酶-2(MAPKK-2)的16个残基的N末端尾部。结构域II类似蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的ADP-核糖基化的毒素，但活化位点已经突变并增大了底物识别性。结构域III插入结构域II中并似乎是来自于结构域II的结构元件的重复复制。结构域IV与锌金属蛋白酶家族相关性远，含有催化中心；其也与结构域I类似。所述结构因此表明蛋白质通过基因复制，突变并与具有高度的不同寻常的特异性的酶融合过程得以进化。 蛋白质的MAPKK家族是LF的唯一已知细胞底物。在LF接近其N末端进行裂解除去了下游同源物MAP激酶的停靠序列。致命毒素对肿瘤细胞的作用，例如是抑制肿瘤生长和血管发生，最可能的是通过抑制MAPKK-1和MAPKK-2途径。然而，在炭疽热发病机理中受影响的主要细胞类型是巨噬细胞。LF已经示出可以从有丝分裂原或胞外信号调节的MAPKK-1，MAPKK-2，MAPKK-3和MAPKK-6，胞外信号调节的激酶1(ERK1)，ERK2和p38的上游激活子中裂解短的N末端片段。最近的数据显示这导致抑制促炎症介导因子，NO和肿瘤坏死因子-α(TNFα)的释放，而不是抑制产生。另外，高水平的致命毒素导致巨噬细胞在几小时内通过未知机制被裂解。最近的数据提示出现这种情况是由于生长因子途径被抑制而导致巨噬细胞死亡。这些观察资料提示在感染的早期阶段，致命毒素可降低(或延缓)免疫应答，而在感染的晚期阶段，血流中高滴度的细菌引发巨噬细胞裂解及突然释放高水平的NO和TNF-α。这可以解释死亡之前的症状，其特征在于宿主巨噬细胞炎症途径的超常刺激，导致剧烈的血压低和休克。这些症状与LPS诱导的脓毒性休克类似。应注意的是LPS-无应答小鼠，如C3H/HeJ，对炭疽热毒素也具有相当的抗性。 LF的识别位点需要存在脯氨酸(P)残基，后接一个疏水性残基或甘氨酸(G)残基，LF在此之间进行裂解。所述识别位点在脯氨酸残基的N末端的5个氨基酸残基内，还需要在所述疏水性残基之后的一个无电荷的氨基酸及至少一个荷阳性电荷的氨基酸(和无阴性电荷的氨基酸，如Asp和Glu)。序列中的其它残基在关键残基之间或在供体和受体之间提供了合适的间隔，因此其组分不是关键的，可包括任何天然或非天然氨基酸。 本专利技术提供了一种调节基因在细胞中表达的方法，包括为所述细胞提供一种信号传导分子，所述分子包含一种小肽，即寡肽或其功能类似物或衍生物。这种分子在此也称为NMPF或者通过数字引用。由于目前易于合成这样氨基酸序列相对短的小肽，及功能类似物和衍生物，因此本专利技术提供了一种调节基因表达的方法，使用易于获得的合成化合物如合成肽或其功能类似物或衍生物进行。 本专利技术还提供了一种治疗炎症病变的方法，包括为需要这种治疗的客体施用一种分子，所述分子包含一种寡肽或其功能类似物或衍生物，所述分子能降低细胞产生的NO，特别是其中所述分子又能调节细胞中存在的基因转录因子的转位和/或活性，尤其其中所述基因转录因子包含NF-κB/Rel蛋白。有利的，本专利技术提供了一种方法，其中调节基因转录因子的转位和/或活性可以调节细胞产生的TNF-α，特别是其中TNF-α的产生被降低。考虑到TNF-α的产生对几乎所有，如果不是全部，炎症病变是重要的，因此降低TNF-α的产生可明显减轻，或缓和在此所述的众多炎症病变。特别地，本专利技术提供了一种方法，其中所述炎症病变包括急性炎症病变，所述方法特别用于治疗炭疽热相关的疾病，尤其当考虑到在炭疽热时，NO和TNF-α的降低将明显缓和疾病的进程。表6列出了具有这种调节作用的本专利技术的寡肽。 特别地，本专利技术提供了一种治疗方法，其中所述治疗包括为客体施用一种药物组合物，所述药物组合物包含能降低细胞产生NO的一种寡肽或其功能类似物或衍生物，优选的，其中所述组合物包含能降低细胞产生NO的至少两种寡肽或其功能类似物或衍生物，这种组合的实施例可以在表6的指导下选择，从而足以选择两或多种具有希望作用的寡肽，例如其中至少两种寡肽选自LQGV，AQGV和VLPALP。 本专利技术还提供了一种分离的，优选合成的，寡肽或其功能类似物或衍生物或者这种寡肽或其类似物或衍生物的混合物，其能降低细胞产生的NO。考虑到这些细胞在炎症过程中的关键作用，这种细胞优选是巨噬细胞或DC系。本专利技术还提供了一种药物组合物，其包含本专利技术的一种寡肽或其功能类似物或衍生物，或者包含至少两种寡肽或其功能类似物或衍生物，其能降低细胞产生的NO。另外，本专利技术提供了能降低细胞产生的NO的寡肽或其功能类似物或衍生物在生产一种药物组合物中的应用，所述药物组合物通过降低治疗客体体内巨噬细胞或DC产生的NO而治疗炎症病变。 肽的功能类似物或衍生物定义为一种氨基酸序列，或其它序列单体，其已经被改变以至所述序列的功能性质基本相同，在数量上非必需相同。可以多种方式提供一种类似物或衍生物，例如通过保守氨基酸取代。也可以设计肽模拟化合物，其功能或结构与作为起始点的原始肽相似，但是它们例如由非天然发生的氨基酸或聚酰胺组成。就保守氨基酸取代而言，一个氨基酸残基用具有一般相似性质(大小，疏水性)的另一个残基取代，由此全部功能很可能不受明显影响。然而，通常更多地需要改良特异性功能。通过系统改良氨基酸序列的至少一种希望的性质也可以提供一种衍生物。这可以，例如通过Ala-扫描和/或置换网状作图方法进行。使用这些方法，基于初级氨基酸序列，产生许多不同的肽，但每种肽均含有至少一个氨基酸残基取代。氨基酸残基可以用丙氨酸置换(Ala-扫描)或者通过任何其它氨基酸残基置换(置换网状作图)。通过这种方式合成原始氨基酸序列的许多位置变体。筛选每个位置变体的特异性活性。产生的数据用于设计有一定氨基酸序列的改良的肽衍生物。 衍生物或类似物也可以例如通过用D氨基酸残基取代L氨基酸残基而产生。这种取代产生实际上不天然发生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种药物组合物，其包含作为活性成分的至少一种由选自如下一组中的氨基酸序列组成的分离的肽：ＡＱＧ，ＬＡＧ，ＬＱＡ，ＬＡＧＶ，ＬＱＡＶ，ＶＬＡＡＬＰ，ＶＬＰＡＡＰ，ＶＬＰＡＬＡ，ＶＡＰＡＬＰＱ，ＶＬＡＡＬＰＱ，ＶＬＰＡＬＰＡ，ＶＶＣＮＹＲＤＶＲＦＥＳＩＲＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳＹＡＶＡＬＳＣＱＣＡＬ，ＶＶＣＮＹＲＤＶＲＦＥＳＩＲＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳＹＡＶＡＬＳＣＱＣ，ＳＩＲＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳ，ＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳ，ＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳ，ＬＰＧＣ，ＣＰＲＧＶＮＰ，ＰＧＣＰ，ＲＰＲＣＲＰＩＮＡＴＬＡＶＥＫＥＧＣＰＶＣＩＴＶＮＴＴＩＣＡＧＹＣＰＴ，ＭＴＲＶＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱ，ＣＡＬＣＲＲＳＴＴＤＣＧＧＰＫＤＨＰＬＴＣ，ＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳ，ＴＣＤＤＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ和ＣＲＲＳＴＴＤＣＧＧＰＫＤＨＰＬＴＣ。

【技术特征摘要】
EP 2001-10-4 01203748.7;US 2001-12-21 10/028,0751.一种药物组合物，其包含作为活性成分的至少一种由选自如下一组中的氨基酸序列组成的分离的肽AQG，LAG，LQA，LAGV，LQAV，VLAALP，VLPAAP，VLPALA，VAPALPQ，VLAALPQ，VLPALPA，VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL，VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQC，SIRLPGCPRGVNPVVS，LPGCPRGVNPVVS，CPRGVNPVVS，LPGC，CPRGVNP，PGCP，RPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPT，MTRVLQGVLPALPQ，CALCRRSTTDCGGPKDHPLTC，SKAPPPSLPSPSRLPGPS，TCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ和CRRSTTDCGGPKDHPLTC。2.权利要求1的药物组合物，其中所述肽选自由AQG，LAG，LQA和VAPALPQ组成的一组中。3.权利要求1或2的药物组合物，其包含至少两种所述分离的肽。4.一种分离的肽，其由选自以下一组中的氨基酸序列组成AQG，LAG，LQA，VAPALPQ，VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL，VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQC，SIRLPGCPRGVNPVVS，LPGCPRGVNPVVS，CPRGVNPVVS，LPGC，CPRGVNP，PGCP，RPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPT，MTRVLQGLVLPALPQ，CALCRRSTTDCGGPKDHPLTC，SKAPPPSLPSPSRLPGPS，TCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ和CRRSTTDCGGPKDHPLTC。5.权利要求4的分离的肽，其中所述肽选自由AQG，LAG，LQA和VAPALPQ组成的一组中。6.至少一种分离的肽在制备用于治疗、抑制或预防NF-κB调节的炎症疾病的药物中的应用，所述疾病选自由哮喘、炎症性肠病、炭疽热、骨病、关节炎、多发性硬化、慢性阻塞性肺病、脑血管疾病和过敏性鼻炎组成的一组中，所述分离的肽具有选自由以下氨基酸序列组成的一组中的氨基酸序列VLPALPQVVC...

【专利技术属性】
技术研发人员：尼萨尔艾哈迈德卡恩，罗贝特本纳，
申请(专利权)人：比奥滕普特公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]